重叠群物理图谱的构建及其应用

人类对各种生物的基因组结构和功能的研究都需要确定DNA序列在染色体上的位置。与遗传图相比,物理图反映了基因或DNA标记之间在染色体上的真实距离。依其作图方法分为三类,即限制性酶切图谱、重叠群图谱和DNA序列图谱。重叠群物理图是将获得的大片段克隆,如YAC、BAC克隆,依其在染色体上的真实顺序排列而成,主要应用于基因组测序、重要基因的图位克隆、靶分子标记开发及比较基因组学研究等,特别是为那些由于缺乏合适的作图群体而不能建立遗传图的物种提供了一个重要的从事基因组学研究的平台。本文综述了近年来重叠群物理图构建研究的主要进展,比较分析了不同重叠群物理图谱构建方法的特点,提出了改进物理作图质量的建议,认为应根据基因组不同区域的特点,综合特异性探针的杂交、PCR筛选、酶切指纹分析、BAC克隆STC延伸、BAC末端测序等多种方法才能完成重叠群的构建。此外,物理图的构建还应努力整合各种基因组的资源和数据,如遗传连锁图、分子细胞遗传图、DNA序列图、EST数据等,这将有助于提高其在基因组学研究中的使用价值及应用范围。文章最后对重叠群物理图的发展趋势进行了展望。     

拷贝数变异的研究方法及其在畜禽中的研究进展

拷贝数变异(copy number variation,CNV)是近年来发展起来的和SNP互补的一种重要的基因组遗传变异形式。它不仅与畜禽的疾病及发育异常有关,还与许多体型外貌特征及经济重要性状相关联。联合使用SNP和CNV这两种遗传标记,将为深入理解畜禽复杂性状的分子机制和遗传基础提供新的思路,并在标记辅助育种中有着广阔的应用前景。全基因组范围内的CNV研究的技术方法主要有比较基因组杂交芯片(CGH)、高密度SNP分型芯片及基于近年来正在兴起的新一代测序技术的全基因组重测序,对于已经检测出的CNV,根据序列特点可以采用基于PCR和杂交的技术方法对其基因型进行判定。2008年以来,利用CGH芯片、高密度SNP芯片和新一代测序等技术对畜禽的基因组CNV开展了一系列研究。本文综述了目前全基因组范围内CNV检测方法及特定CNV的分型方法,并列举了CNV在畜禽中的所取得的一系列研究进展,为从事同类研究的人员提供一定的参考资料。     

外源λDNA导入普通小麦雄性不育变异的分子验证

将外源λDNA导入普通小麦品系 81 45 2 7,获得一细胞质雄性不育变异体 ,稳定成系 ,简称D型不育系 ,受体 81 45 2 7可作其保持系。用32 P标记的λDNA作为探针 ,对受体 81 45 2 7、D型不育系及其与鲁麦 1 4号的杂种F1 核DNA和叶绿体DNA进行点杂交。实验结果表明 :D型不育系及杂种F1 核DNA和叶绿体DNA点杂交均呈阳性反应 ,而受体无阳性反应。说明外源λDNA片段已经整合进了不育变异体核基因组和叶绿体基因组中 ,并且可以稳定遗传。该结果从分子水平上初步证明了外源DNA导入技术的可靠性     

基因芯片技术检测5种马病毒

通过分子克隆技术获得马疱疹病毒1型(Equineherpesvirus1,EHV1)、马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)、马流感病毒(Equineinfluenzavirus,EIV)、马传染性贫血病毒(Equineinfectiousanaemiavirus,EIAV)和东部马脑脊髓炎病毒(East-ernequineencephalomyelitisvirus,EEEV)等5种病毒各一段高度保守的特异性基因片段,用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。提取样品中的RNA,进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述5种病毒,可检测到阳性杂交信号的最高稀释度为10-6的病毒液,约25个病毒DNA拷贝,但其它病毒材料未见红色荧光信号,证明了本方法的特异性。在进口马的隔离检疫期间,采集马鼻肺炎、马动脉炎中和抗体阳性但病毒分离阴性马匹的白细胞悬液,分别在EHV1和EAV位点处可检测到阳性杂交信号。证明基因芯片技术不但快速、准确和敏感,而且可同时进行多种病毒的检测。     

基因芯片技术检测5种马病毒的研究

通过分子克隆技术获得马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus 1, EHV1)、马动脉炎病毒(Equine arteritis virus , EAV)、马流感病毒(Equine influenza virus, EIV)、马传染性贫血病毒(Equine infectious anaemia virus , EIAV)和东部马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus, EEEV)等5种病毒各一段高度保守的特异性基因片段，用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上，制备成检测芯片。提取样品中的RNA，进行反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交，对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示，制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述5种病毒，可检测到阳性杂交信号的最高稀释度为10-6的病毒液，约25个病毒DNA拷贝，但其它病毒材料未见红色荧光信号，证明了本方法的特异性。在进口马的隔离检疫期间，采集马鼻肺炎、马动脉炎中和抗体阳性但病毒分离阴性马匹的白细胞悬液，分别在EHV1和EAV位点处可检测到阳性杂交信号。证明基因芯片技术不但快速、准确和敏感，而且可同时进行多种病毒的检测。     

异养氨氧化细菌基因组DNA的检测方法比较

氨氧化细菌是参与土壤氮素循环的重要微生物类群之一,其基因组DNA提取质量的准确分析,可直接影响后续分子实验的可行性和精确性。本试验针对3株异养氨氧化细菌的纯培养菌株,应用琼脂糖凝胶电泳、微量紫外分光光度计和Qubit荧光计分别检测不同提取方法获得的基因组DNA的浓度,同时结合细菌通用引物扩增16S r DNA全长来判定提取DNA的质量,进而筛选出可用于检测可培养氨氧化细菌基因组DNA浓度的方法。研究结果表明,针对不同浓度的DNA样品,尽管3种检测方法获得的结果表现出明显差异,但在16S r DNA-PCR中均仍能获得良好的扩增结果。与微量紫外分光光度法相比,Qubit方法对基因组DNA浓度的检测结果更为精确,特别在低浓度DNA检测中,能够较真实的反映基因组DNA的实际情况。     

杂草基因组学研究进展及策略

本文分析了杂草的特异性和基因组特点,列出杂草基因组学研究的候选模式杂草植物种.论述了分子作图、比较基因组学、RNAi、TILLING、T-DNA插入突变和基因芯片等技术在杂草基因组学研究中的应用现状,以期全面认识和解析控制杂草特异性状的遗传基础和调控机理.重点阐述了杂草基因组学研究进展及加快杂草基因组学研究的技术策略,指出开展杂草基因组学的研究有利于建立科学控制杂草技术体系,改良作物产量和品质,从而提高农业的可持续生产力.     

基因组学在作物抗逆性研究中的新进展

自然环境中各种生物和非生物胁迫是影响作物产量的巨大威胁。随着现代分子生物学的发展,从分子水平研究作物抵御逆境的机理已成为生态农业研究的一个重要任务,分子遗传学与生态学的整合诞生了生态基因组学即用基因组学的技术和手段研究生态学领域的问题。基因组学按其研究内容分为功能基因组学、结构基因组学和比较基因组学,本文从这3方面分别阐述了作物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的生态基因组学研究进展,总结了基因组学在植物抗逆性研究中的一些新技术和新手段,特别是基于近几年发展起来的二代深度测序所带来的一系列高通量的检测方法与结果。①功能基因组学包含转录组学、表观遗传学、蛋白组学、相互作用组学、代谢组学和表型组学,本文侧重从植物抗逆的功能基因表达水平上的研究展开,重点探讨了转录组学和表观遗传学在植物抗逆研究的新进展,介绍了一些转录组学和表观遗传学研究技术,如基因芯片技术、RNA测序技术、SAGE、cDNA-AFLP、SSH、亚硫酸盐法、ChIP-Chip、ChIP-seq等;例举了一些转录因子基因家族在植物抗逆反应中的作用,总结其作用共性,结果表明不少抗逆基因受到胁迫后基因转录激活上有一定相关性,大多受激素信号转导途径所调控,很多抗逆途径最终都涉及到ABA信号传导通路并与衰老相关;植物的抗逆性受多个信号通路调控,对同一逆境响应常常需要不同的转录因子共同参与,而同一转录因子也有可能参与2个以上的不同抗逆反应;表观遗传学则指在不改变基因序列前提下,对DNA甲基化修饰、组蛋白翻译后修饰及小RNA介导的信号传导等,有证据表明其存在遗传印记作用。②结构基因组学主要利用QTL定位和DNA测序技术,确定植物基因组的遗传图谱和物理图谱,二代深度测序平台的建立使许多植物的全基因组测序成为可能。迄今为止,已有超过40种植物完成全基因组测序,越来越多的植物全基因组计划正在实施中或预计实施。③比较基因组学是基于功能基因组学和结构基因组学进而比较不同物种或不同群体间的基因组差异和相关性的研究,可分析逆境响应相关基因在进化过程中及在地理位置分布中的作用和意义,也同时为QTL定位及功能基因组学研究提供丰富信息。此外,还简要介绍并列举了一些网络共享作物抗逆的生物信息资源数据库。虽然基因组学在如何正确处理海量数据等问题上还存在瓶颈,但它提供的大量作物抗逆方面的基因组信息已为植物抗逆研究提供了众多线索与依据,为今后改良作物抗逆性的遗传育种工作带来了新启示。     

结合不对称PCR技术构建鸡NDV-IBV-ILTV联合检测基因芯片

基因芯片(gene chip)是依据核酸杂交原理发展的一种生物新技术,在生命科学研究领域具有重要的应用价值.本研究将不对称PCR和基因芯片两种技术相结合,构建了同步检测鸡(Gallus gallus)传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的共检基因芯片.分别选取ILTV的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)和糖蛋白B(glycoproteins B,gB)基因、NDV的融合蛋白(fusion,F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(haemagglutinin-neuraminidase,HN)基因以及IBV的膜蛋白(membrane,M)和核衣壳(nucleocapsid,N)基因设计引物,从重组质粒菌中扩增制备探针基因,用乙醇沉淀法纯化后点制于氨基修饰的载玻片上,制备基因芯片;靶基因用cy3标记引物,进行不对称PCR扩增,扩增的荧光标记单链产物与芯片杂交.不对称PCR结果显示,当限制性引物与非限制性引物浓度比例在1:10时ILTV-TK、NDV-HN和IBV-N的单链产物增加最多,当浓度比在1:20时,ILTV-gB、NDV-F和IBV-M的单链产物增加最多;相应的标记样品与3种病毒检测芯片杂交后,均出现较强的杂交信号,而阴性对照检测不到荧光信号,灵敏性实验表明,当DNA浓度为1.8x 104拷贝时杂交仍为阳性.本研究构建的诊断基因芯片对12份临床样品进行初步应用检测,与PCR检测技术检出率基本一致.本实验所建立的联合检测基因芯片能够快速、准确、高通量的诊断NDV-IBV-ILTV,可以应用于集约化养殖业中对多种鸡疫病病毒的检测.     

我国动物生物育种产业现状及发展策略探讨

随着分子生物学技术的快速发展,动物育种已经步入了以数量遗传学、分子遗传学等多学科理论指导的分子育种时代.动物生物育种展现出重大的应用价值和产业化前景,有利于推动我国畜禽养殖业良种的选育和本土化进程.本文主要综述了国内外动物全基因组选择和动物基因组编辑技术等生物育种技术的发展历程、研究进展和应用情况,并从技术创新和技术产业化角度,分析了我国动物种业发展现状和存在的问题,提出了促进生物种业发展的对策和建议.     

6天龄与10天龄大鼠的睾丸组织的基因差异表达

通过基因芯片技术,利用Roche-NimbleGen公司制作的大鼠12×135K全基因组表达谱芯片,对日龄为6d和10d的大鼠睾丸组织进行全基因组表达差异分析。结果显示：具有2倍以上的差异表达基因有4298个,其中表达上调的基因共1878个,表达下调的基因共2420个。这些差异表达的基因中有3154个基因具有基因本体注释,参与了154个生物学通路。进一步分析表明具有8倍以上差异表达的基因有13个,这些基因参与了生物学过程、细胞组分和分子功能等基因本体分类,进一步选择3个差异表达的基因,LOC686076、Cxcl6和Trib3,做了实时定量RT-PCR检测。其结果趋势与芯片数据一致。因此,我们初步认为精原干细胞的发生与增殖在大鼠早期的发育过程中已经有大量的基因参与,是一个多基因协调表达的过程。     

12个物种miR-302基因簇的生物信息学分析

很多microRNA（miRNA）基因在基因组上聚集排列形成miRNA基因簇。miRNA基因簇在进化上较为保守,有其特殊的生物学意义。miR-302基因簇在胚胎干细胞中特异表达,对胚胎干细胞的自我更新和多潜能维持有重要的作用。本文采用miRBase数据库查询和BLAST同源搜索方法共搜寻并分析了12个物种的miR-302基因簇。生物信息学分析表明,这些物种miR-302基因簇均位于LARP7蛋白基因的内含子区,但转录方向与LARP7基因转录方向相反。序列相似性分析显示,同一物种miR-302簇成员间以及不同物种相应miR-302簇成员间相似性均较高。进化分析表明,基因复制可能是miR-302基因簇进化的主要驱动力。     

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSB1细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA（chicken telomerase RNA,chTR）全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列。序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465bp,其中模板区的11个核苷（5＇-CUAACC-CUAAU-3＇）合成端粒亚单位（TTAGGG）n。chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础。     

洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

本研究采用PCR方法克隆了洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。同源性分析表明,CAS19的cepR核苷酸序列与Burkholderiacepacia LMG1222cepR基因的同源性为99％;cepR基因全长768bp,包含一个完整的231bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸;该基因编码蛋白分子量为26．59kD,理论的等电点为5．55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。     

PEG胁迫下玉米基因表达谱分析

为了解PEG胁迫下玉米基因表达情况,采用数字化基因表达谱（DGE）技术,检测了20%PEG胁迫下玉米植株中基因表达谱,同时利用实时荧光定量PCR技术对部分基因表达特点进行了验证。结果表明玉米植株在20%PEG胁迫下48h时,共检测到31829个基因表达量发生了改变,其中表达量差异达到2倍以上的基因共1438个,其中801个表达量呈现上调,637个表达量呈现下调。这些差异表达基因功能主要涉及到结合、催化、转录、抗氧化剂活性,参与代谢过程、细胞过程、定位、生物调节、定位建立以及刺激反应等。实时荧光定量PCR分析表明7个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。本研究表明玉米对PEG胁迫反应是一个多基因参与、多个生物过程协同调控的过程,基因表达量的变化可能是调控的主要方式,此外候选了与玉米耐PEG胁迫相关的应答关键基因,为揭示与玉米耐旱机理以及克隆与玉米耐旱性相关关键基因奠定了基础。     

猪肺泡巨噬细胞感染PRRSV进程中差异表达基因及基因功能富集分析

猪呼吸和繁殖综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）感染猪后会引起妊娠母猪严重繁殖障碍和仔猪呼吸困难及高死亡率,给养猪产业造成了巨大经济损失,因此挖掘PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞进程中差异表达的基因及机理有重要意义。本研究对来自GEO数据库的PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞sage表达谱数据GSE10346进行后续挖掘。先用sage软件处理,经sagemap注释得到上调已知基因49个,下调已知基因41个。利用AgBase网站上的GORetriever工具和GOSlim Viewer工具进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）及参与的生物过程（biological process）分类后发现有4个基因与病毒的复制相关：其中IL8已有报道认为与抗PRRSV相关;TNF-α能够抑制PRRSV复制;PPIA可能与GP5蛋白胞外区中和决定簇与抗体发生作用的24位脯氨酸有关;ICAM-1在嗜中性粒细胞的产生中起关键作用,与病毒吸附相关。这4个基因与PRRSV的致病机制相关,可望用于抗PRRSV研究。进一步利用David在线工具进行基因功能富集分析后,发现几个免疫通路,如趋化因子通路,Toll-like受体信号通路和NOD-like受体信号通路具有检验显著性,这些免疫通路在PRRSV感染过程中起着一定作用,有望成为抗PRRSV的靶通路。     

绵羊HSPA1L基因的生物信息学分析

为了解绵羊热休克蛋白1L (heat shock protein family A member 1 like，HSPA1L) 基因及其编码产物的基本结构和生物学特征，给绵羊的抗热应激和免疫等方面的研究提供依据，利用生物信息学数据库及软件对绵羊HSPA1L基因进行生物信息学分析。结果表明，该基因最大长度的ORF有1 926 bp，编码641个氨基酸序列。其编码的蛋白质分子式为C3094H4985N859O969S20，理论等电点为5.89，不稳定指数为32.56。该蛋白无信号肽和跨膜结构，为非分泌性蛋白，主要在细胞质中发挥生物学作用。无规则卷曲是构成该蛋白二级结构和三级结构的主要方式。     

白沙蒿肌动蛋白基因核心片段的克隆和序列分析

本研究以荒漠植物白沙蒿总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增出肌动蛋白基因核心序列。将获得的片段克隆到T载体后进行测序,序列分析表明：白沙蒿肌动蛋白基因核心片段长599bp,编码198个氨基酸。将该序列在GenBank中注册,并与多种植物肌动蛋白序列进行同源性比较,发现该片段的核酸序列同源性在75％以上,氨基酸序列同源性在85％以上,具有高度保守性。     

植物基因定点突变与定点置换技术及其在作物遗传改良中的应用

随着大量植物基因组测序工作的完成及EST数据库的充实，利用基因定点突变与定点置换技术精细的研究基因功能是功能基因组学研究的重要手段。同时，基因定点突变与定点置换技术可以克服现有转基因技术的基因沉默和位置效应等诸多缺陷，在植物遗传改良方面具有重要的意义。基因定点突变与定点置换技术在酵母和小鼠胚胎干细胞中已经比较成熟，但在高等植物中同源重组频率非常低，限制了其使用。新近研究发现，利用锌指核酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）引入DNA分子的定点断裂（double-strand breaks, DSBs）可以高效介导基因的同源重组，使得ZFN成为遗传工程的一个研究热点。利用嵌合寡核苷酸(Chimeric oligonucleotides)可以介导基因的单碱基定点突变，在植物遗传改良上有广阔的应用前景。对同源重组相关的调控途径进行基因修饰也可以提高植物的基因打靶效率。植物基因定点突变与定点置换技术难题的攻克，必将加快植物功能基因组研究的步伐，同时给植物基因工程育种带来新的革命。     

乳腺癌细胞中Rab7基因的克隆及序列分析

本实验主要是从人乳腺癌细胞中克隆Rab7基因并进行基因序列比对和分析。通过培养乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB231,提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,以此cDNA为模板,根据GenBank公布的人Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框。将其与真核表达载体pc-DNA3.1连接,构建pcDNARab7重组质粒。测序后发现MCF-7细胞中克隆的Rab7序列与GenBank序列的同源性为91%,发生了多处突变,其中94.4%为同义突变,5.5%为错义突变。但是MDA-MB231细胞中克隆的Rab7基因序列与GenBank中的Rab7序列的同源性为100%。由于发现Rab7在MCF-7乳腺癌细胞中发生突变,而在MDA-MB-231乳腺癌细胞中基因未发生突变,我们推测Rab7基因的突变是否与乳腺癌的产生有关系,这个发现为以后研究Rab7与乳腺癌的关系奠定了基础。