鸡毒霉形体黏附蛋白与鸡胚不同组织黏附特异性的研究

利用pGEX融合蛋白表达系统,将鸡毒霉形体黏附蛋白（pMGA）在大肠杆菌BL21中表达,经 GST·Bind Resin 纯化,用蛋白酶Thrombin切掉GST标签,获得纯度为96%的pMGA,Western-blot鉴定具有良好的免疫学活性。通过间接免疫荧光组织化学法（IFA）来检测pMGA与SPF鸡胚的气管、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、十二指肠、法氏囊、胸腺和脾脏等组织的特异性结合情况,结果表明,除脾脏外,其余组织与pMGA之间能产生特异性结合,说明这些组织中存在pMGA的受体蛋白。这为进一步研究pMGA的受体提供理论依据。     

HSP70及HSP70 mRNA在热应激肉鸡组织中的定位

利用间接法免疫组织化学技术和RNA探针原位杂交技术，研究了HSP70 及HSP70 mRNA在热应激6 h处理肉鸡心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、胸腺和法氏囊等组织中的分布。结果显示，热应激6 h时HSP70 mRNA主要分布在肉鸡肝脏和肺脏中的血管壁及其周围，心肌纤维也有少量阳性信号，而脾脏、法氏囊和胸腺等组织未检出现阳性信号；热应激6 h时HSP70主要分布在所检肉鸡各种组织的血管壁。提示HSP70与热应激肉鸡心血管系统具有相关性，可能与心血管系统的功能和损伤有关。     

GH、IGF1及其受体基因在蒙古马不同器官中的表达差异

生长激素(growth hormone,GH)具有调节生长节奏的能力。本研究旨在探索GH、生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)以及其受体IGF1R(insulin-like growth factor 1 receptor)在蒙古马(Equus caballus)不同器官中的表达差异。选取4匹平均年龄2岁的蒙古马为研究对象,利用qRT-PCR和免疫组化检测蒙古马不同器官中的GH、GHR、IGF1及IGF1R的表达水平并进行分析。qRT-PCR结果表明,GH基因在脾脏中的表达高于淋巴、心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌、尾肌(P0.05),GHR基因在肝脏表达量最高,其次为胰腺、尾肌、睾丸、心脏、骨骼肌、淋巴、肾脏、脾脏、肺脏(P0.05),IGF1基因在肝脏表达高于其他组织器官(P0.05),IGF1R基因的表达量依次为肺、肝脏、脾脏、睾丸、心脏、肾脏、淋巴、骨骼肌、尾肌、胰腺(P0.05)。免疫组织化学检测结果显示,GH、IGF1蛋白在肝脏、肾脏、睾丸、骨骼肌和脾脏中均有分布,阳性反应强度不等。根据阳性细胞数得出,GH蛋白在肝脏、脾脏的阳性表达量高于其他组织器官(P0.05)。IGF1的阳性表达量在肝脏中最高,脾脏、肾脏、睾丸次之,骨骼肌最少(P0.05)。本实验通过RNA水平和蛋白水平两个层面的研究,发现GH、GHR、IGF1、IGF1R在蒙古马各器官中的表达具有差异性,为蒙古马的选育工作提供基础资料和科学依据。     

鸡C/EBPα抗血清制备及组织表达的特性

制备鸡（Gallus gallus）CAAT增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα）的多克隆抗血清,并分析其组织表达特性。通过限制性酶切,从T-C/EBPα质粒中获得C/EBPα基因的编码区序列（coding sequence,CDS）,构建原核表达载体,以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主,用IPTG诱导重组pGEX6p/C/EBPα的表达,经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗鸡C/EBPα多抗。ELISA方法测定抗体效价达1∶12800,Western blot方法显示抗体具有较高的特异性。用此抗血清分析了鸡C/EBPα的组织表达特性,结果表明,鸡的回肠、肾脏、肌胃、腺胃、心脏、肝脏、腹脂、脾脏等组织中C/EBPα蛋白表达量较高,而在胸肌、腿肌中表达量较低。同时分析C/EBPα基因在高低脂系公鸡肝脏组织中的表达差异,结果显示该基因在低脂系公鸡肝脏中表达量较高。     

表达人CD47基因的巴马小型猪创建及其表达分析

异种器官移植是解决供体器官短缺的有效途径之一,猪(Sus scrofa)是人类(Homo sapiens)异种器官移植的理想供体.然而,异种移植物进入受体后将被受体巨噬细胞清除,其主要原因是巨噬细胞表面的受体-信号调节蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特异地识别异种细胞表面的整合素相关蛋白(integrin associated protein,IAP又称CD47),导致移植物细胞被受体内的巨噬细胞吞噬并清除.本研究在敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴马小型猪基础上,转入hCD47基因,制备表达hCD47基因的GTKO/hCD47巴马小型猪,可避免超急性排斥反应并减弱受体巨噬细胞对移植物细胞的吞噬.首先构建巨细胞病毒增强子和鸡β肌动蛋白启动子(cytomegalovirus early enhancer/chicken β-actin promoter,CAG)调控的hCD47基因表达载体pCAGGS-hCD47-Neo,转染GTKO巴马小型猪的耳成纤维细胞,然后通过体细胞克隆技术制备转基因克隆猪.利用PCR对克隆仔猪进行转基因鉴定,通过qRT-PCR、Westem blot和免疫组化等方法分析hCD47在转基因猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺等组织的表达.抽取存活仔猪血液进行生理指标检测,监测其健康状况.通过体细胞克隆技术获得了13头转基因克隆猪,PCR鉴定均为hCD47基因阳性猪.qRT-PCR结果显示,hCD47基因在各器官中的表达量由高至低依次为胰腺、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和心脏.Western blot及免疫组化结果进一步证实hCD47基因在胰腺、肝脏等中均具有较强表达,与qRT-PCR结果一致.血液生理指标显示,存活仔猪健康状况良好.本研究成功制备了表达hCD47基因的GTKO巴马小型猪,确证了hCD47基因在主要器官中的表达特征,将有助于探究hCD47基因在减弱受体巨噬细胞对异种移植各器官的排斥反应.     

鸡肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)抗血清制备及组织表达特性分析

制备鸡(Gallus gallus)肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)的多克隆抗血清,并分析L-BABP的组织表达特性.利用RT-PCR扩增L-BABP基因的CDS区,构建鸡L-BABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T/L-BABP.将重组表达质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导后产生GST/L-BABP融合蛋白,利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST/L-BABP融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清.诱导得到了1个38 kD(12 kDL-BABP+26 kD GST)的融合蛋白,经间接ELISA方法测定制备的抗血清效价为1:100 000.利用此抗血清分析鸡L-BABP的组织表达特性,结果表明该基因仅在肝脏组织中特异性表达,在肾、肺、腿肌、腺胃、胸肌、心脏、脂肪、脾、回肠、肌胃、空肠和十二指肠等12种组织中没有检测到表达信号.本研究制备的高效价、高特异性的鸡L-BABP抗血清,为从蛋白水平上深入研究L-BABP的生物学功能提供了良好的基础.     

不同剂量CpG-ODN佐剂与ALV-Jgp85重组蛋白联合免疫诱导种母鸡血清抗体和母源抗体的比较

为比较不同剂量非甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)免疫佐剂与J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis virus,ALV-J)gp85重组蛋白联合免疫后诱导母鸡血清抗体和母源抗体的效果,利用原核表达系统制备包含gp85基因的重组蛋白作为免疫原,与不同剂量CpG免疫佐剂联合接种成年海兰褐父母代种母鸡(Gallus domesticus),首免后2周加强免疫一次,于接种前和接种后每周动态检测血清抗体,接种后部分鸡只每周收集种蛋,检测卵黄抗体。结果显示,利用原核表达系统制备的gp85重组蛋白能与ALV-J单克隆抗体JE9特异性结合;与3个不同剂量CpG联合免疫成年种母鸡后均诱导鸡只产生一定效价的血清抗体,首免后28 d效价最高;所诱导的卵黄抗体效价首免后第4周最高。其中以50μg/羽剂量的CpG联合重组蛋白接种鸡只诱导的血清抗体和卵黄抗体效价和阳性比例最佳,100μg/羽剂量的CpG次之。3个不同剂量的CpG与ALV-J gp85重组蛋白联合免疫均能诱导母鸡产生一定的血清抗体和卵黄抗体,50μg/羽剂量的CpG联合免疫的效果明显优于较高剂量的免疫效果。本研究为使用CpG联合ALV-J gp85重组蛋白诱导母鸡产生母源抗体,阻断ALV-J早期感染提供科学依据。     

Dazl基因在绵羊不同发育期睾丸组织中的表达与细胞定位

类无精症缺失基因(deleted in azoospermia-like gene,Dazl)在雄性动物生殖细胞分化过程中起重要调控作用,但对于不同物种或处于不同发育阶段的同一物种而言,其调控机制存在差异。为了探讨Dazl在绵羊(Ovis aries)不同发育期睾丸组织中的表达、定位及调控作用,本实验选取0、2、5、12和24月龄健康的绵羊15只,每组3只,采取睾丸、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织。运用实时荧光定量PCR(quantitative Real time PCR,q RT-PCR)检测了0、2、5、12和24月龄绵羊睾丸组织及12月龄绵羊的不同体组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉)中Dazl m RNA的表达量,利用Western blot技术对Dazl基因编码蛋白的表达量进行检测,并采用免疫组织化学染色方法检测Dazl蛋白的阳性信号在不同月龄睾丸组织中的分布情况。结果显示,对于不同月龄睾丸组织,从m RNA和蛋白水平均检测到了Dazl基因的表达,并且二者的趋势基本相似。在0、2和5月龄睾丸中Dazl m RNA及蛋白表达量较低,12月龄中表达量较高且极显著高于0、2和5月龄(P0.01),而在24月龄中Dazl m RNA及蛋白的表达量均出现不同程度的下调现象。12月龄绵羊各组织的q RT-PCR检测结果显示,Dazl m RNA只在睾丸组织中高表达,在心脏中表达量很低,而在其他组织中不表达。免疫组织化学染色结果显示,Dazl蛋白在初情期前(0、2和5月龄)定位于睾丸间质细胞,而在12和24月龄定位于睾丸间质细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞。研究结果表明,Dazl基因在性成熟前公羊的睾丸间质细胞及成年羊的睾丸间质细胞、精母细胞和精细胞中表达,并且在他们的增殖过程中起调控作用。由此推测,在绵羊睾丸发育过程中,Dazl基因可能通过直接作用(调控精母细胞的成熟分裂)和间接作用(调控睾丸间质细胞的增殖)共同调控精子发生。本研究为进一步研究Dazl基因在雄性动物精子发生过程中的调控机制提供了科学依据和参考。     

手掌参多糖对60Co-γ射线辐射小鼠造血和抗氧化功能损伤的治疗作用研究

为研究手掌参多糖对电离辐射损伤小鼠造血和抗氧化功能的治疗作用,本试验选用48只健康雌性昆明小白鼠,随机分为8组,分别为空白组,辐射组,手掌参多糖低、中、高给药组(150、300、600 mg·kg^-1 组)和辐射低、中、高给药组;辐射组和辐射给药组分别用⁶⁰Co-γ射线进行辐射,辐射剂量5.0 Gy(剂量率0.8 Gy·min^-1)。分别在照射后 30 min内灌胃相应剂量的手掌参多糖和生理盐水(空白组、辐射组),连续5 d。末次灌胃后48 h内测定所有小鼠外周血细胞计数、脾脏指数、肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量、骨髓DNA含量、骨髓嗜多染红细胞微核 (MN) 数目及脾脏T淋巴细胞亚群。结果表明,与空白组相比,给药组小鼠抗氧化能力和造血系统得到不同程度的改善,辐射组外周血细胞计数、脾脏指数、骨髓DNA含量、肝脏抗氧化能力及T淋巴细胞亚群极显著降低,MDA含量与MN数目显著升高; 与辐射组相比,辐射给药组小鼠脾脏指数和T-AOC、SOD活性极显著升高,DNA含量、外周血细胞计数也有所升高,CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞比率升高,MDA含量、MN数目显著降低。上述试验结果表明,手掌参多糖对⁶⁰Co-γ射线照射造成的小鼠造血、抗氧化功能损伤具有治疗作用。本研究为手掌参多糖对辐射损伤的治疗提供了技术参考。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/Duck/FuJian/01/02株感染性克隆构建

摘 要：1999-2002年本试验室从我国南方健康鸭体内分离到21株H5N1亚型禽流感病毒,对其进行系统地生物学特性和遗传演化分析发现,其中A/Duck/FuJian/01/02(简DKFJ)和A/Duck/Guangxi/53/02(简DKGX) 属于同一基因型, 对鸡都呈高致病性,但对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性明显不同: DKGX对小鼠呈低致病性（MLD50>106.5）,DKGX株反向基因操作系统本试验室已经建立,而DKFJ对小鼠呈高致病性（MLD50<100.5）。为了研究这两株病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠致病性差异的分子机制,本研究构建了对DKFJ的8质粒反向基因操作系统,并通过细胞转染技术成功拯救了该病毒（R-DKFJ）。R-DKFJ在对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病性保持了与亲本野生毒（W-DKFJ, MLD50<100.5）一致的生物学特性,并且对小鼠呈全身感染,即106EID50鼻腔感染小鼠后第三天在脑、脾、肾、肺脏等脏器检测到病毒。DKFJ反向基因操作系统的成功建立为阐明H5N1亚型禽流感病毒对哺乳动物模型Balb/c小鼠的致病机制等方面奠定了基础。