苹果甘露糖结合蛋白2基因(MdMBP2)的克隆及其重组蛋白的活性研究

甘露糖结合蛋白(MBP)是一类包含B-lectin结构域的植物凝集素,通过与糖的结合参与多种生理过程,包括细胞和细胞之间的相互作用以及寄主和病原之间的相互作用等.为了探讨苹果甘露糖结合蛋白在抗轮纹病防御反应中的作用,本研究从苹果(Malus demestica)枝条韧皮部cDNA鉴定了一个甘露糖结合蛋白的编码基因,命名为MdMBP2(GenBank accession No.JX126857).该基因全长1 553 bp,开放阅读框为1 368 bp,编码一个由455个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量和等电点分别为50.4 kD和8.68.该蛋白的氨基酸序列包含保守的B-lectin结构域,N端有27个氨基酸残基组成的信号肽,C端有一个PAN-apple结构域.同源性和系统演化分析显示,MdMBP2蛋白与葡萄(Vitis vinifera)和大豆(Glycinemax)的表皮分泌蛋白(EP)及拟南芥(Arab idopsis thaliana)的甘露糖结合蛋白具有较高的序列相似性.包含B-lectin结构域的蛋白可以分成两个群,MdMBP2属于Class Ⅰ,与ClassⅡ蛋白相比,Class Ⅰ缺少SLP结构域和蛋白激酶结构域.利用荧光定量PCR技术检测MdMBP2基因的表达,发现MdMBP2基因在被检测的几种组织中均有不同程度的表达,但在皮和叶中的表达量较高,这种表达模式表明,MdMBP2可能参与多种生理途径.另外,轮纹病病原菌(Botryosphaeria dothidea)侵染能诱导MdMBP2转录本的积累,且其时序表达变化与轮纹病发病过程相关,暗示该基因参与了苹果抗轮纹病的防御反应.通过体外重组表达MdMBP2基因的重组蛋白,并用重组蛋白进行糖结合实验,发现MdMBP2蛋白能与真菌细胞壁组分高甘露糖型聚糖和甘露寡糖有较高的结合活性,表明MdMBP2蛋白可能参与病原真菌的识别.本研究分离鉴定了一个新的苹果甘露糖结合蛋白的编码基因,认为该基因参与苹果对轮纹病病原的防御反应,可能在寄主对病原的识别过程中发挥作用.     

STMP在拟南芥分枝发育过程中的功能鉴定

拟南芥(Arabidopsis thaliana)中含有脂/固醇结合的相关脂转移蛋白结构域(steroidogenic acute regulatory related lipid transfer,START)的膜相关蛋白(START domain containing-membrane related protein,STMP),STMP是START保守域(第84～295位)功能未知的蛋白质,由440个氨基酸组成、具有跨膜片段、属于磷脂酰胆碱转运蛋白.为明确STMP在拟南芥发育调控过程中的作用,深入了解拟南芥发育调控的分子机理,本研究用35S强启动子启动START结构域,构建START结构域的过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染花序法把STMP的过表达载体转入野生型拟南芥,获得过表达STMP的转基因拟南芥,并用qRT-PCR技术进行验证;分析转基因拟南芥分枝发育状况,明确STMP在拟南芥分枝调控过程中的作用;用qRT-PCR技术分析STMP的时空表达特性;构建STMP和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的融合蛋白载体,把此载体转入野生型拟南芥中,对转基因拟南芥中GFP进行荧光观察,从而对STMP进行亚细胞定位.本研究获得了过表达STMP的转基因株系;过表达STMP的转基因拟南芥分枝比野生型明显增多,突变体stmp的分枝减少;STMP的时空表达特性分析表明,茎中STMP的表达量最高,STMP定位在细胞质膜和细胞质中.结果表明STMP可以促进拟南芥的分枝发育,本研究对完善拟南芥分枝调控机制具有重要的意义,可以为植物株型的定向设计提供理论依据.     

以增加催化结构域的基因重构方法提高里氏木霉外切型葡聚糖酶Ⅱ的活性

分别通过增加CBHⅡ和EGⅣ催化结构域的方式对里氏木霉QM9414外切型葡聚糖酶Ⅱ进行基因重构。第一种重构方式是在CBHⅡ基因的上游增加EGⅣ的催化结构域基因，第二种重构方式是在CBHⅡ基因的下游增加其自身的催化结构域基因。通过PCR和基因重构手段获得重组质粒pPICZαA -cdE –cbh2和pPICZαA- cbh2-cdC，并在毕赤酵母GS115中表达，获得重组菌株P.pastoris PEC11和P.pastoris PCC16，在经改良的摇瓶培养条件下能表达具有较高CMCNa酶活性的融合蛋白，培养液的CMC活性分别达到3.87U/ml和7.66U/ml，其中P.pastoris PCC16表达的重构酶活性是毕赤酵母表达的单一CBHⅡ酶活性的2倍。表明采用增加结构域的方式可以有效提高纤维素酶的活性。     

甘蔗果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶基因(F2KP)的克隆及其功能研究

果糖-6-磷酸,2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶(fructose-6-phosphate,2-kinase/ fructose2,6-bisphosphatase,F2KP)是影响生物碳积累和分配的调控关键酶,同时也是一个具有激酶和酯酶两种催化活性的双功能酶.本研究在已获得甘蔗(Sacc harum officinarum)蔗叶F2KP(命名为SoF2KP-L)的基础上,以蔗茎cDNA为模板克隆获得不同长度的同源片段,分别命名为SoF2KP-S1、SoF2KP-S2和SoF2KP-S3.生物信息学分析结果显示,SoF2KP-L翻译的蛋白具有完整的激酶和酯酶结构域,SoF2KP-S1、SoF2KP-S2和SoF2KP-S3所含开放阅读框长度均小于SoF2KP-L,其中SoF2KP-S1翻译的蛋白只具残缺的激酶结构域;SoF2KP-S2翻译的蛋白具完整激酶结构域但缺失酯酶结构域;SoF2KP-S3只能翻译数个氨基酸即终止翻译.选择双功能域完整的SoF2KP-L构建表达载体,农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum).RT-PCR证实,SoF2KP-L在转基因植株成熟叶中转录表达.碳水化合物等生理指标测定结果表明,转基因植株成熟叶片中可溶性总糖/淀粉、还原糖/淀粉、蔗糖/淀粉比值均有不同程度的升高,碳水化合物含量和相关分配比率发生改变.研究结果提示,甘蔗中可能存存不同的F2KP转录产物,并初步证实甘蔗SoF2KP-L在光合组织中对蔗糖和淀粉的分配起到一定的调控作用,为进一步研究甘蔗F2KP基因的功能及为甘蔗分子育种提供参考依据.     

鳗鲡肠道高产α-淀粉酶菌株的筛选、鉴定及其代谢特征分析

肠道细菌对宿主肠道营养物质的代谢吸收发挥着重要作用.oα-淀粉是鳗鲡(Anguilla anguilla)配合饲料中的主要组分,为研究鳗鲡肠道细菌对α-淀粉的代谢作用,本研究从健康鳗鲡肠道内分离筛选出高产α-淀粉酶的细菌菌株MJ18,通过形态学观察和16S rRNA序列分析鉴定为迟钝爱德华氏菌9 Edwardsiella tarda).动力学分析结果显示,菌株MJ18所产α-淀粉酶的米氏常数Km=4.64 mg/mL,最大反应速度Vmax=45.45 mg/(min· mL).Biolog碳代谢特征研究结果显示,菌株MJ18对碳源的利用具有选择性,其中对糊精、麦芽三糖和丙酮酸等3种碳源的利用率最高,代谢活性强的碳源类型为核苷类,代谢活性弱的碳源类型为氨基酸类.本研究为揭示鳗鲡肠道细菌在α-淀粉代谢过程中的作用提供科学依据.     

鸡C/EBPα抗血清制备及组织表达的特性

制备鸡（Gallus gallus）CAAT增强子结合蛋白α（CAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα）的多克隆抗血清,并分析其组织表达特性。通过限制性酶切,从T-C/EBPα质粒中获得C/EBPα基因的编码区序列（coding sequence,CDS）,构建原核表达载体,以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主,用IPTG诱导重组pGEX6p/C/EBPα的表达,经Glutathione Sepharose 4B柱层析纯化后,以其为免疫原制备兔抗鸡C/EBPα多抗。ELISA方法测定抗体效价达1∶12800,Western blot方法显示抗体具有较高的特异性。用此抗血清分析了鸡C/EBPα的组织表达特性,结果表明,鸡的回肠、肾脏、肌胃、腺胃、心脏、肝脏、腹脂、脾脏等组织中C/EBPα蛋白表达量较高,而在胸肌、腿肌中表达量较低。同时分析C/EBPα基因在高低脂系公鸡肝脏组织中的表达差异,结果显示该基因在低脂系公鸡肝脏中表达量较高。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

来源于水牛瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶的碱性羧基末端结构域的功能鉴定

本碱性羧基末端结构域（basic C-terminal domain,BTD）是瘤胃细菌的碳水化合物活性酶（carbohydrateactive enzymes）中未知功能的一个结构域。BTD都位于酶或蛋白质的羧基最末端,大小为30～80个氨基酸（aa）,含有较多的碱性氨基酸,一般该结构域等电点都大于10。本工作构建了来源于水牛瘤胃未培养微生物的内切葡聚糖酶C5614-1的BTD缺失酶C5614-1RBTD57（缺失C5614-1羧基末端的57个aa）和C5614-1RBTD40（缺失C5614-1羧基末端的40个aa）以及C67-1的BTD缺失酶C67-1ΔBTD（缺失C67-1羧基末端的42个aa）,酶学特性分析发现BTD缺失酶与野生酶对pH和温度的稳定性是相似的,说明BTD结构域对酶的酶学特性方面贡献不大。尽管缺失了C5614-1的羧基末端57个氨基酸后,缺失酶C5614-1RBTD57对温度和pH的稳定性明显降低,但同时缺失酶对Avicel的结合能力也显著下降,说明该缺失酶是因为该酶的碳水化合物结合组件（carbohydrate binding module,CBM）的部分缺失而导致了酶的稳定性的改变。本文还对BTD可能的功能做了预测。     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs) 作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK 信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230~439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E. coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 kDa位置出现与预期一致的条带。同时,CIPK18在低温胁迫后葡萄叶片中蛋白表达水平与室温下相一致,但两种状态下均存在可能的磷酸化与泛素化修饰现象。本研究结果为进一步探究VaCIPK18的蛋白定位、表达及其功能奠定了基础。     

荷斯坦奶牛杀菌/通透性增加蛋白N端cDNA在大肠杆菌中的融合表达

参照GenBank中安哥斯牛杀菌/通透性增加蛋白(BPI)序列,设计合成1对引物.应用RT-PCR技术,从荷斯坦奶牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白N端,将该序列与原核表达载体pGEx-4T-1连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BPI.重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3),用IPTG诱导表达.结果表明,获得了BPIN端长度为714bp的cDNA序列,序列分析证实在第503位出现了点突变.重组质粒诱导表达后,经SDS-PAGE电泳检测重组蛋白约在52 kD处出现特异性蛋白条带.     

基于无人机航拍与改进YOLOv3模型的云杉计数

为解决目前苗木计数由人工完成而导致的成本高，效率低，计数精度不能得到保障的问题，该研究以自然环境下的云杉为研究对象，以无人机航拍云杉图像和拼接后完整地块云杉图像为数据源，根据云杉尺寸差异大和训练样本小的特点提出一种基于改进YOLOv3（You Only Look Once v3，YOLOv3）模型的云杉计数模型。该模型将密集连接模块和过渡模块引入特征提取过程，形成Darknet-61-Dense特征提取网络。通过694幅无人机航拍云杉图像测试表明，密集连接模块和过渡模块可解决YOLOv3模型小样本训练过拟合问题和云杉特征丢失问题，改进YOLOv3模型可以快速准确实现云杉计数，在精确率P、召回率R、平均精度AP、平均计数准确率MCA和平均检测时间ADT这5个评价指标上达到96.81%、93.53%、94.26%、98.49%和0.351 s；对比原有YOLOv3模型、SSD模型和Faster R-CNN模型，精确率P分别高2.44%、4.13%和0.84%。对于拼接后完整地块云杉图像，改进YOLOv3模型的5个评价指标的结果分别为91.48%、89.46%、89.27%、93.38%和1.847 s；对比原有YOLOv3模型、SSD模型和Faster R-CNN模型，精确率P分别高2.54%、9.33%和0.74%。该研究为利用无人机快速准确统计苗木数量的关键步骤做出有益的探索。     

非计算机专业VFP程序设计教学改革与实践

分析了现行非计算机专业VFP程序设计课程教学中存在的问题进,结合教学实践,探讨了对非计算机专业的VFP课程教学改革方案。     

面向大规模多类别的病虫害识别模型

早期病虫害精准识别是预警和防控的关键,但是病虫害种类繁多数量巨大,外部形态存在类间相似度较高而类内差异性较大等性状特征,导致病虫害识别仍然是一项极具挑战的工作。为实现病虫害识别分类任务中差异化特征的提取和表示,该研究提出一种大规模多类别精细病虫害识别网络模型（a large-scale multi-category fine-grained pest and disease network,PD-Net）。首先通过在基准网络模型中引入卷积块注意力模型,通过混合跨特征通道域和特征空间域实现模型在通道和空间两个维度上对关键特征提取和表示,用以增强网络对差异化特征的提取和表示能力。其次引入跨层非局部模块,提升模型在多个特征提取层之间对于多尺度特征的融合。在61类病害数据集和102类虫害数据集上的试验结果表明,对比AlexNet、VGG16、GoogleNet、Inception-v3、DenseNet121和ResNet50模型,该研究提出的面向大规模多类别病虫害识别模型,Top1识别准确率在病害和虫害集上分别达到88.617%和74.668%,精确率分别达到了0.875和0.745,召回率分别达到0.874和0.738,F1值达到0.874和0.732,试验结果对比其他模型均有一定幅度的提升,验证了PD-Net模型在大规模多类别病虫害识别上的有效性。     

黄曲霉毒素B_1吸附菌株的筛选及吸附机理研究

为获取能够高效吸附黄曲霉毒素B1(AFB1)的益生菌,研究16株益生菌对培养基中AFB1的吸附效果。结果表明,11株菌株对AFB1具有明显的吸附效果,其中酿酒酵母Y1吸附效果最佳,对其菌体处理方式和吸附时间进行优化后,对AFB1的吸附率可达81.16%。复合物稳定性试验结果表明,Y1与AFB1通过物理方式结合,且该结合可逆。加热处理可使各菌株的AFB1吸附能力显著增强。扫描及透射电镜观察发现,加热处理后Y1菌体表面由光滑变得凹凸不平,并且其细胞壁厚度增加至原来的148.73%,与AFB1的接触面积增加,从而导致Y1对AFB1的吸附能力明显增强。     

L'electrode potassium pour l'analyse des tissus vegetaux (The potassium electrode for plant tissue testing)

Abstract

A potassium specific‐ion electrode equiped with a “sensing module” was compared with atomic absorption for potassium determination in plant tissue. The potentiometric readings were stable and reproducible, and were of the same order of magnitude as those obtained by atomic absorption. The correletion coefficient obtained between the two analytical methods were highly significant; but it was higher for corn leaves, sugarbeet leaf‐blades and petioles respectively.     

基于Web的数字农业系统平台研究与设计

数字农业系统是一个集信息化、数字化、网络化与自动化等多种现代高新技术为一体的,融合现代农业技术的智能化农业生产、管理和应用系统。在充分分析数字农业系统的研究意义、内涵和研究内容的基础上,给出了网络环境下数字农业系统的总体设计思路、方法和架构,并详细探讨了数字农业系统核心功能模块的主要功能及设计结构,以及未来物联网环境下数字农业系统,乃至智能农业系统地研究发展方向和趋势。     

云南蔗区甘蔗栽培专家系统的设计

根据云南蔗区的自然生产条件，总结甘蔗栽培专家的思路，以甘蔗高产高糖高效为目标，采用DET 1.1农业专家系统开发工具，以栽培管理模式、病虫害防治技术数据库为外接口，研究开发了集甘蔗高产栽培、田间管理、病虫害诊断防治、甘蔗生产全年管理工作历等为一体、文字与图片、影像等多媒体形式与用户交互的甘蔗栽培专家系统。     

基于改进HRNet的单幅图像苹果果树深度估计方法

针对苹果自动采收获取果树深度信息的实际需求,以及目前单幅图像深度估计算法存在的空间分辨率低和边缘模糊问题,提出一种基于改进高分辨率网络（High-Resoultion Net, HRNet）的单幅图像苹果果树深度估计模型。首先基于HRNet构建多分支并行的编码器网络,提取多尺度特征,并通过引入密集连接机制强化特征传递过程中的连续性;为了减少冗余特征造成的噪声干扰,使用卷积注意力模块在通道及像素层级对融合特征进行重标定,强化特征图结构信息。在解码器网络中,使用条纹细化模块自适应地优化特征图的边界细节信息,突出边缘特征,改善边缘模糊问题,最后经上采样生成深度图。在NYU Depth V2公共数据集和果园深度数据集上进行试验。试验结果表明,引入密集连接机制,添加卷积注意力模块、条纹细化模块均能提升模型性能。提出的改进HRNet网络在果园深度数据集上的平均相对误差、均方根误差、对数平均误差、深度边缘准确误差和边缘完整性误差分别为0.123、0.547、0.051、3.90和10.76,在不同阈值下的准确率达到了0.850、0.975、0.993;在主观视觉上,改进HRNet网络生成的深度图有清晰的边缘以及较多的纹理细节。本文方法在客观指标和主观效果上均有良好的表现。     

Magnesium- und Calcium-Ernährung von Hochlagenfichten —Vergilbungszustand und Reaktion auf unterschiedliche Düngung

Magnesium and calcium nutrition of spruce on high altitude sites — yellowing status and effects of fertilizer application On the ARINUS experimental sites in the Schwarzwald (SW Germany) since 1987 the mineral nutrition of Norway spruce was investigated using various experimental fertilizer treatments. The studies were focused on the nutrient Mg as acute Mg deficiency symptoms were observed at the beginning of the experiments. Treatments with ammonium sulfate, kieserite and dolomitic limestone were carried out to achieve an experimental modification of the Mg supply. In this paper, results on yellowing status, long-term foliar analysis, and data on the binding forms of Mg and Ca in the needles are presented. By application of Mg containing fertilizers the Mg nutrition of the trees could be markedly improved. Thus, deficiency symptoms disappeared. Kieserite application resulted in the fastest response of foliar Mg concentrations. In contrast to Mg, Ca deficiency could not be observed. The results of the (NH₄)₂SO₄ application show that high N input in ecosystems can amplify latent deficiency of mineral elements. Recently on many sites the risk of nutrient imbalances has developed as a consequence of improved N supply due to deposition. Thus, nutritional and site specific aspects should be payed more attention when liming and fertilization measures are planned. A higher percentage of deep rooting tree species as beech and fir could be useful for stabilizing mineral nutrition of forest canopies.     

农业设备嵌入式数据库缓存管理器的设计与实现

综述了嵌入式数据库缓存技术的发展现状,分析了目前较为常用的缓存替换算法,基于农业设备的嵌入式数据库这个特定应用领域,结合其特点提出了一种缓存块大小可变的缓冲管理结构和基于CLOCK替代策略的专用缓冲管理机制。详细阐述了该缓存管理器的设计思路和具体实现细节。