嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

F18菌毛粘附素F基因(fedF)在大肠杆菌中的表达及对小鼠的免疫保护效果

引起早期仔猪断奶腹泻(PWED)的主要致病菌是产肠毒素型大肠杆菌(ETEC),免疫预防是防治腹泻最主要的手段。本研究采用通过大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组F18菌毛粘附素F(FedF)作为抗原,在小鼠(Mus musculus)中探索以此为靶标免疫防治仔猪腹泻的可能性。根据相应F18菌毛粘附素基因(fedF)设计了一对添加EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以E.coli F18为模板扩增出全长908bp含20个信号肽序列的fedF片段,并与原核表达载体pET-30a(+)连接,导入大肠杆菌BL21,得到基因工程菌E.coli[pET-fedF],后经IPTG诱导及菌液蛋白电泳分析,结果表明,大小约为32.9kD的重组蛋白FedF可成功诱导表达;将重组工程菌口服免疫BALB/c小鼠,可有效地诱导小鼠血清中FedF特异性IgG的产生(P/N值>2.0)及小鼠肠粘膜sIgA显著增加了2.07倍(与空载体组pET-30比较)(P<0.05);攻毒试验表明,口服基因工程菌E.coli[pET-fedF]可显著地有效保护小鼠免予攻毒死亡,免疫保护率可达62.5%。研究结果提示,FedF黏附蛋白基因工程菌可通过口服诱导小鼠特异的体液和粘膜免疫反应,以此保护小鼠免受产肠毒素型大肠杆菌的进攻,因而有望作为一种口服疫苗防治产肠毒素型大肠杆菌引起的仔猪腹泻。     

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶活性片段的表达和对小鼠的免疫试验

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)J-1株温敏胞外蛋白酶EprJ1的表达产物是否具有酶活性和抗原性及测定对小鼠的相对保护率,根据eprJ1基因ORF阅读框的序列设计1对引物,扩增出不含信号肽序列的EprJ1成熟蛋白结构基因(850bp),经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后连接pET-32a( ),转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21。在30℃经IPTG诱导后,重组菌冻融液在脱脂奶平板上经28℃和24h孵育检测有透明溶蛋白圈出现,经56℃和30min处理后则无。纯化的重组蛋白免疫小鼠后,用1.0×107cfu的AhJ-1(50LD50)腹腔注射攻击小鼠,重组蛋白对小鼠的相对保护率可达60%。免疫印迹显示,AhJ-1胞外产物的抗血清可以识别该融合蛋白,但AhJ-1的热稳定胞外蛋白酶ECPase54抗血清不能识别该融合蛋白。重组蛋白分子量约53.2kD,有温敏蛋白酶活性和抗原性。     

耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA)工程菌的构建及其表达条件

从Bacillus sp.110-2基因组上分离得到的耐碱锰超氧化物歧化酶基因(Mn-sodA),将其连接到原核表达载体pET-30a(+),得到重组载体pET-sodA,重组载体在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导得到表达.SDS-PAGE分析显示,融合表达产物的分子量大小为26.5 kD.对含有sodA基因工程菌的表达情况研究表明,重组蛋白全部以可溶性形式存在;重组酶的比活力252 U/mg,为原始菌株的2.1倍,目的基因在大肠杆菌中实现了高效表达;而且,重组酶还保留了野生型酶强的耐碱能力.BL21(pET-sodA)基因工程菌的构建提供了一种可利用的耐碱蛋白资源,同时探索了一种极端酶的生产方法.     

肠毒素性大肠杆菌mSTⅠ-linker-LTB融合蛋白的表达及免疫保护试验

用分子生物学方法拼接成肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)mSTⅠ-linker-LTB融合基因,并定向克隆到pET-32α( )中,转化宿主菌(E.coli)BL21(DE3)。重组菌经1mmolLIPTG诱导,在30℃下,5h时表达产物(分子量约为37kD)达到高峰,表达量约占菌体总蛋白30%。表达产物主要存在包涵体中,经Westernblot鉴定呈阳性。乳鼠胃内接种实验证明,融合蛋白无野生型STⅠ的生物毒性。将融合蛋白与矿物油乳化后免疫ICR小鼠,对K88、K99、987P和F41的保护率分别为83.3%、100%、66.7%和66.7%。     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因(ahyR)突变株的构建及特性分析

根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)转录调控蛋白基因ahyR序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kanr)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因同源突变株,命名为J-1△ahyR。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colonyformingunits)。该研究为ahyR基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。     

鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株的构建及鉴定

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)能引起多种鱼类暴发性出血性败血症,为研制更加安全的嗜水气单胞菌口服活疫苗,构建了鱼源嗜水气单胞菌aopB-/aopD-/aroA-缺失株。首先构建含缺失369 bp的aopB/aopD基因(编码嗜水气单胞菌外膜蛋白B、D)与蔗糖敏感基因(sacB)的重组自杀性质粒pREaopB/aopD,与嗜水气单胞菌Ah2056接合转移,应用二步法筛选aopB-/aopD-缺失株,PCR证实aopB/aopD基因的缺失突变。在此基础上,构建另一个含缺失1 290 bp的aroA基因(编码5-酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)与庆大霉素抗性片段（aacC1片段）的重组自杀性质粒pSUParoA,与aopB-/aopD-缺失株接合转移,利用庆大霉素抗性筛选aopB-/aopD-/aroA-缺失株,用PCR证实aroA基因的缺失突变。进一步对aopB-/aopD--/aroA-缺失株进行生长特性、对鱼的毒力等生物学特性鉴定。结果表明,aopB-/aopD-/aroA-缺失株构建成功,且该缺失株为毒力丧失、营养缺陷株。     

表达猪源链球菌类M-MRP融合蛋白基因工程菌的构建及免疫保护试验

利用PCR技术,分别扩增马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp.zooepidemicus)ATCC35246株类Mszp基因583￣1063位碱基和猪链球菌(S.suis)2型HA9801株mrp基因298￣827位碱基的片段。通过在类M基因片段的3!端和mrp基因片段的5!端引物添加共同的SacⅠ酶切位点,利用T4连接酶连接,克隆至pET-32a( )载体。将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21,经IPTG诱导,可获得分子量约为60kD的融合蛋白。通过MRP和类M蛋白的多克隆抗体进行ELISA反应和免疫印迹分析表明:表达的融合蛋白同时具有类M蛋白和MRP的抗原性。用组氨酸亲和层析柱纯化的重组融合蛋白,和链球菌的全菌二联灭活疫苗分别免疫两组仔猪,重组蛋白的免疫保护率达60"。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

犬瘟热病毒磷蛋白的表达及抗体制备

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)是一种急性高度接触性传染病病原,可引起犬(Canis)、猫(Felis)等多种属动物发热、腹泻、肺炎和中枢神经系统紊乱,其磷蛋白(phospho-protein,P)在病毒复制和致病中具有重要作用。本研究根据犬瘟热病毒P蛋白基因(GenBank No.AF164967)设计引物,RT-PCR扩增得到CDV-P基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-CDV-P,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株,异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组his-CDV-P蛋白,His-band纯化后获得高纯度重组蛋白,纯化蛋白免疫balb/c小鼠,制备了小鼠抗CDV-P抗体,检测CDV感染细胞内P蛋白的表达和细胞定位,检测不同感染时间细胞内P蛋白的表达。SDS-PAGE电泳结果表明,获得重组蛋白的分子量大小为65 kD,表达的蛋白以包涵体形式存在,占总菌体蛋白的35%以上,纯化后占总蛋白60%以上;Western blot检测表明,小鼠抗CDV-P抗体能特异性识别原核表达产物和病毒感染表达产物,CDV-P在感染细胞内具有两种表现形式(磷酸化和非磷酸化);间接免疫荧光结果显示,该蛋白在胞浆和胞核中都存在;CDV-P在病毒感染的早期和晚期都有表达,随着感染时间延长表达逐渐增加,并且其磷酸化水平也逐渐增加。本研究制备了重组P蛋白和多克隆抗体,检测了P蛋白在感染细胞内的表达和定位,为P蛋白功能和CDV致病机理研究提供基础资料。     

Use of murine models to detect the allergenicity of genetically modified Lactococcus lactis NZ9000/pNZPNK

By introducing aprN into Lactococcus lactis NZ9000, the genetically modified L. lactis NZ9000/pNZPNK successfully expressed the nattokinase. The safety assessment of this novel strain was based on allergenicity of pepsin digestion stability and murine model serologic identity. Subjecting to the GM strain and host to pepsin digestion, the soluble fractions and cell debris were fast degraded completely. Feeding with ovalbumin resulted in significantly higher production of IgG1 and IgE as compared to that of L. lactis NZ9000/pNZPNK or L. lactis NZ9000. Further, the serum IgG2a level increased dose-dependently at week 2 and induced immune reaction toward Th1 pathway. Secretion of cytokines IL-4 and IL-10 fed with lactococci was significantly lower than that of the OVA group. L. lactis NZ9000/pNZPNK did not increase the proliferation of type 2 helper T cells in spleen or induce allergenicity in BALB/c mice. On the basis of the results, the new GM lactic acid bacterium is regarded as safe to use.     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。     

胡子鲶败血症病原菌的研究

由患细菌性败血症的胡子鲶苗种分离到6个菌株，经菌株致病力测试、生化鉴定和药物敏感试验，结果表明嗜水气单胞菌是胡子鲶苗种败血症的病原菌，该病原菌对卡那霉素、恶喹酸、呋喃唑酮、丁胺卡那霉素等敏感，而对磺胺等9种药物不敏感。     

SjFer与GM-CSF共表达核酸疫苗对小鼠免疫保护效果的研究

【摘要】：目的 探讨粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)对日本血吸虫铁蛋白核酸疫苗抗攻击感染免疫保护力的影响。 方法 以pGEX-5x-3/SjFer为模板，PCR扩增SjFer，以小鼠总RNA为模板RT-PCR扩增GM-CSF。常规方法构建SjFer/pc、GM-CSF-SjFer/pc及GM-CSF/pc。85只雌性供试小鼠随机分为5组，即生理盐水、pcDNA3.0、GM-CSF/pc、SjFer/pc、GM-CSF-SjFer/pc组，每组小鼠17只。于0，2，4周注射纯化质粒50 ug/次到每只小鼠左后肢股四头肌。每次免疫前尾静脉采血收集血清，ELISA检测血清内特异性IgG水平。末次免疫后一周每组随机选5只小鼠无菌取脾，MTT法检测淋巴细胞增殖情况。末次免疫后两周每只经腹部感染(40±1)条尾蚴，45 天后宰杀小鼠，以观察减虫率和减卵率。结果 SjFer/pc和GM-CSF-SjFer/pc均可诱导小鼠血清内特异性IgG水平。SjFer/pc和GM-CSF-SjFer/pc诱导小鼠产生的减虫率分别为36.27 ％和39.22 ％，减卵率分别为36.10 ％和49.04 ％。结论 GM-CSF对SjFer/pc的免疫保护力有增强作用。     

Functional secretion of a type 1 antifreeze protein analogue by optimization of promoter, signal peptide, prosequence, and terminator in Lactococcus lactis

Lactococcus lactis is a food-grade microorganism of major commercial importance. Antifreeze protein is a potent cryogenic protection agent for the cryopreservation of food and pharmaceutical materials. In this study, extracellular expression of a novel recombinant type I antifreeze protein analogue (rAFP) in L. lactis was optimized. An efficient SlpA promoter (P SlpA) was fused to various signal peptides (SPs) and propeptide sequences to examine the extracellular expression levels of rAFP. An efficient signal peptide, SP sacB, fused to prosequence AE, enabled higher extracellular rAFP production; use of the SlpA terminator (Ter SlpA) was a further improvement. The extracellularly expressed rAFP successfully inhibited ice recrystallization and is thus potentially applicable for cryogenic preservation.     

法氏囊素在大肠杆菌中的表达及其免疫增强活性

选用大肠杆菌(Escherichiacoli)编码赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的常用密码子按顺序排列成BS基因:5'-AAACACGGT-3'。连续合成10个BS(BS10)串连基因单链及其反向互补链,通过退火使其复性成双链。BS10基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆进表达载体pGEX-6P-1中。获得的重组质粒pGEX-Bur转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,串连的BS10基因获得了高效表达。表达产物经GST亲和层析和胰酶消化处理后,按适当的浓度和新城疫病毒(NDV)混合,免疫90只30日龄的小白鼠。分别在免疫后第7,14和21天,用血凝抑制试验(HI)测定小鼠血清中NDV的抗体水平,结果加入囊素的实验组比不加囊素的对照组HI平均高出22.5个滴度。同样的实验样品免疫100只8日龄SPF(speclficpathogenfree)鸡,15d后实验组的抗体水平比对照组平均高出20.7个滴度。研究结果证实了用大肠杆菌表达的法氏囊素对小鼠和鸡具有免疫增强的作用。     

猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体ELISA检测方法研究

通过TMpred生物学软件分析猪水肿毒素(SLT-IIe) A亚基蛋白质结构并设计引物、构建表达质粒使基因片段获得可溶性表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表达产物具有可溶性从而主要存在于裂解上清液，易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明该可溶性蛋白不能致死小白鼠，也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明表达产物的兔抗血清能高效中和SLT-IIe（中和度90.4℅）。在小鼠免疫保护力试验中，表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立的检测SLT-IIe抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可用于临床猪水肿病的诊断。     

杆状病毒J 结构域蛋白基因的克隆、表达和抗体的制备

摘要：斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）bjdp (baculovirus J domain protein) 基因是杆状病毒基因组中唯一编码J 结构域蛋白的基因。利用PCR方法扩增得到此全长基因，将其克隆到5'端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上并转化E. coli M15[pREP4]， 在IPTG诱导下表达了一个分子量为36 kD的融合蛋白。以纯化过的6×His-BJDP融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，得到该蛋白的抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。