氟对鲤鱼鳃组织免疫相关酶及IL-1β表达影响

以鲤鱼为受试材料,研究水环境中氟对其血液和鳃组织免疫相关酶ACP、AKP、SOD、CAT的活性,NBT阳性细胞数量及白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达的影响。结果显示,在不同浓度氟化钠(0、40、80、120 mg·L-1)暴露30 d后,与对照组比较,鲤鱼血液中、鳃组织中的氟含量都有增加,且呈一定的剂量效应关系;鲤鱼血清中免疫相关酶ACP和AKP活性低于对照组,且在80、120mg·L-1显著低于对照组,SOD、CAT活性在120mg·L-1显著低于对照组;鲤鱼鳃中免疫相关酶ACP、AKP、SOD、CAT低浓度组活性较高,而高浓度组较低,且均在120 mg·L-1显著低于对照组;随着水环境氟暴露浓度的升高,鲤鱼NBT阳性细胞数量均较对照组低、鲤鱼鳃组织中的IL-1β蛋白表达也均较对照组低。CORREL相关分析结果显示,水氟暴露浓度与鲤鱼免疫相关酶活性ACP、AKP、SOD、CAT活性和IL-1β蛋白表达呈一定的剂量效应关系。实验结果表明:水环境中氟可在一定程度上对鲤鱼鳃免疫能力产生抑制作用。     

苯并芘(BaP)对鲤鱼肝、肾抗氧化、非特异性免疫能力及组织结构的影响

为探究苯并芘(BaP)对鲤鱼的毒性机制,本研究检测了不同浓度BaP(0、0.1、0.5、1.0 μg·L^-1)暴露对鲤鱼肝、肾组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及非特异性免疫酶溶菌酶(LZM)、酚氧化酶(PO)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)活性,以及硝基四氮唑兰(NBT)阳性细胞及肝、肾组织结构的影响。结果表明,1.0 μg·L^-1 BaP暴露30 d后,鲤鱼肝、肾组织SOD活性、MDA含量及肝组织CAT、肾组织GSH活性均显著低于对照组;1.0 μg·L^-1 BaP暴露的肝、肾组织LZM、AKP和PO活性以及肝组织ACP活性均显著低于对照组;不同浓度BaP暴露30 d后,鲤鱼NBT阳性细胞数均显著下降,且对肝、肾组织造成不同程度的损伤。相关性分析结果表明,BaP暴露浓度与肝、肾组织的SOD活性呈负相关,与MDA含量呈正相关,与肝、肾组织的AKP、ACP、PO活性呈负相关,与NBT阳性细胞数呈负相关。综上,水体中BaP暴露对鲤鱼肝、肾抗氧化和非特异性免疫能力及组织结构产生了一定程度的负面影响,本研究为水体中BaP的生态毒性效应研究提供了理论参考。     

Z0206细菌富硒多糖对小鼠的免疫调节作用研究

本试验通过建立环磷酰胺（CP）诱导的免疫抑制小鼠模型,研究了Z0206细菌富硒多糖的免疫调节功能。试验分为四个处理：Ⅰ组为对照组;Ⅱ组为CP组;Ⅲ组为细菌富硒多糖组;Ⅳ组为细菌富硒多糖预防组。结果表明,与对照组相比,细菌富硒多糖组小鼠免疫器官指数、NK细胞活性、血液溶血素水平（HC50）和脾细胞抗体形成数（PFC）均显著提高（p<0.05）,T细胞亚群增殖有所提高,但差异不显著（p>0.05）。与CP组相比,细菌富硒多糖预防组能使CP诱导的免疫抑制得到修复,改善试验小鼠免疫器官指数、T淋巴细胞和自然杀伤细胞（NK）活性、血液溶血素水平和脾细胞抗体形成数,差异显著（p<0.05）。提示：细菌富硒多糖能增强小鼠的免疫功能,对CP诱导的免疫抑制具有修复作用。     

犬白细胞介素2在毕赤酵母中的诱导表达及生物活性的测定

以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因，将目的片段连接到pMD18-T载体，测序结果显示，扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上，得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2，经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌，甲醇诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带，比实际分子量略大，推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明，重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。     

牛白介素32基因可变剪接体(IL-32γ)的分子克隆及功能验证

牛白细胞介素32(interleukin-32,IL-32)基因是近年发现的一种新型功能基因,是一种炎症性细胞因子,其主要作用是诱导其他细胞因子和化学因子的产生,并在自身免疫性炎症性疾病中发挥重要作用,可促进细胞凋亡,从而抑制结核分支杆菌(Mycobacterium)等多种分支杆菌感染,提高动物机体抗病能力。本研究从秦川牛(Bos taurus)脾脏组织中分子克隆了牛IL-32β基因及其可变剪接体IL-32γ基因,经序列分析表明,该基因定位于牛25号染色体上,实验克隆的牛IL-32β基因与NCBI中已发表序列有5个碱基不同,通过蛋白二级序列比较,该差异并不影响蛋白的折叠,推测这几个碱基差异是秦川黄牛IL32基因的SNP。IL-32γ比IL-32β序列多了第二内含子,导致编码序列多编码47个氨基酸。为了研究该可变剪接体的功能,本研究构建了真核表达载体pIRES-IL32γ-GFP。将该载体稳定转染小鼠(Mus musculus)巨噬细胞RAW264.7,获得超表达牛IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞,同时以稳定转染人IL-32γ基因的小鼠巨噬细胞为阳性对照,Real-timePCR检测表明,超表达牛IL-32γ具有调节IL-1β、IL-6、MIP2、TNFα等细胞因子的功能,其趋势与阳性对照人IL-32γ的趋势相近。本实验研究为进一步研究牛IL-32γ基因生物学功能打下了基础。     

猪Nramp1基因启动子克隆及其组织表达活性分析

Nramp1基因在猪肺泡巨噬细胞中具有较高的组织表达特异性,本研究的目的是克隆并分析猪(Sus scrofa)Nramp1基因在肺泡巨噬细胞中的特异性表达调控元件.本研究首先利用5'RACE技术确定了Nramp1基因转录起始位点,在此基础上构建了-1 327～+86 bp区域内不同长度的嵌套缺失片段,分别连接至pGL3-BASIC载体上,构建了pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、pLUC379、pLUC274及pLUC179共8个缺失表达载体.采用脂质体转染法,与海肾荧光素酶载体共转染猪肺泡巨噬细胞、肾细胞、脂肪前体细胞和胎儿成纤维细胞,采用双荧光素酶报告系统验证了Nramp1基因不同启动子片段的表达活性,结果表明Nramp1基因核心启动子区位于-386～-173 bp.进一步比较了pLUC487[-386～+86]启动子区在巨噬细胞、猪肾细胞、脂肪细胞和胎儿成纤维细胞中的表达活性,结果表明Nramp1基因在巨噬细胞中的表达活性极显著地高于肾细胞、脂肪细胞和成纤维细胞(P<0.01),表明Nramp1基因启动子具有较高的巨噬细胞特异性.本研究获得了能够在猪肺泡巨噬细胞中特异表达的调控元件,为进一步实现外源基因在猪肺泡巨噬细胞中的特异性表达提供了基础.     

氟对鲤鱼肾抗氧化酶和Na~+-K~+-ATPase水平的影响

为探究氟对鲤鱼的毒性机制,本试验检测了不同浓度(0、40、80、120 mg·L~(-1),分别标记为CK、T1、T2、T3)下,水相氟暴露对鲤鱼肾组织抗氧化酶SOD、CAT、LPO含量及Na~+-K~+-ATPase活性的影响,并通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法检测了水相氟暴露对其肾组织Na~+-K~+-ATPase蛋白表达的影响。结果表明,在不同氟浓度下暴露30 d后,T2、T3的SOD、CAT、Na~+-K~+-ATPase活性均显著低于CK,LPO含量呈升高趋势且显著高于CK;Na~+-K~+-ATPase蛋白表达分析表明,T2、T3的Na~+-K~+-ATPase蛋白的表达显著低于CK。相关性分析表明,氟暴露浓度与SOD、CAT、Na~+-K~+-ATPase活性呈负相关(Pearson系数分别为-0.586,-0.707,-0.818,P0.01),与LPO含量呈正相关(Pearson系数为0.762,P0.01),与Na~+-K~+-ATPase蛋白的表达呈负相关(免疫印迹法Pearson系数为-0.769,P0.01,免疫荧光法Pearson系数为-0.848,P0.01)。结果表明,水体中氟可在一定程度上对鲤鱼肾抗氧化酶和Na~+-K~+-ATPase水平产生抑制作用。本研究为更深入研究水氟的毒性效应提供了理论依据     

重组马白细胞介素-18生物学活性的测定及单克隆抗体中和活性鉴定

应用实时荧光定量RT-PCR方法评价了大肠杆菌表达的重组马白细胞介素-18（rEIL-18）蛋白在商品化的重组人IL-12（rhIL-12）协同作用下刺激马外周血单核细胞（PBMCs）产生EIFN-gamma的情况。在rhIL-12的协同作用下,rEIL-18在体外刺激马PBMCs产生EIFN-gamma的效应是阴性对照的20倍之多,并且在一定rhIL-12浓度的条件下,rEIL-18在体外诱导马PBMCs产生EIFN-gamma的能力是呈一定的剂量依赖性。此外,评价了制备的9株抗rEIL-18单克隆抗体中和rEIL-18的生物学活性的能力,证实其中1株可中和rEIL-18的生物学活性,并且呈一定的剂量依赖性。结果表明：首次获得原核表达的具有生物活性的rEIL-18,其活性可被1株抗rEIL-18单克隆抗体中和。     

不利用香菇多糖的香菇单核菌株的选育

以香菇939菌株的担孢子为材料,应用紫外线诱变得到1株不能利用香菇多糖的突变株939-5,其菌落形态和生长速度与未突变H型单核菌株相同,多糖产量比未突变H型单核菌株提高30.7%,比双核菌株提高19.6%。该菌株产香菇多糖的最适碳源是淀粉,氮源为酵母膏,培养基初始pH值为6.0;Mg2+ 对其产香菇多糖有显著的促进作用;高溶氧水平则对产香菇多糖有明显的抑制作用。这些产香菇多糖的特性与已报道的香菇939菌株的S1型单核菌株相同。     

生姜提取物对LPS诱导RAW 264.7细胞炎症反应的干预作用研究

以新鲜生姜为原料制备不同温度干燥的生姜提取物,在LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型上研究生姜提取物的抗炎活性及机理,明确提取物中主要活性成分。采用冷冻干燥、烘箱60℃干燥、烘箱90℃干燥3种方式对新鲜生姜进行干燥,用70%乙醇水溶液超声提取得到3种生姜提取物。利用体外抗氧化实验(TEAC、 FRAP和DPPH)比较3种提取物的抗氧化活性,在LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型上研究3种生姜提取物对细胞NO、 IL-6、 IL-1β和PGE2分泌、炎症相关基因以及NFκB通路蛋白表达的影响,最后利用HPLC-MS明确3种提取物中主要活性成分的差异。结果显示,生姜提取物表现出抗氧化活性,且可以通过调控NFκB通路抑制LPS诱导RAW264.7细胞促炎因子的分泌和炎症相关基因表达。随着干燥温度的升高,生姜提取物的抗氧化和抗炎活性得到显著提高,主要得益于生姜中姜酚向姜烯酚的转变。     

鲤CC型趋化因子CCL-C5a样基因的克隆、组织表达与进化分析

趋化因子家族是一类能诱导白细胞激活和迁移的趋化性细胞因子家族,是鱼类先天免疫的重要组成部分.CC类家族是趋化因子家族中最大的家族之一.为研究鲤CC类家族成员的组织表达和进化模式,以及进一步研究鲤CC类趋化因子的免疫调控机制,本研究选择该家族其中的一个基因,CCL-C5a样基因,根据EST序列结合RACE方法从鲤(Cyprinus carpio)脾脏中克降了该基因的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ026408).该序列全长830 bp,5端非翻译区174 bp,3端非翻译区296 bp,开放阅读框360 bp,编码一个由119个氨基酸组成的蛋白.结构域分析发现,该蛋白质含有分泌信弓肽和保守的趋化因子结构域;Gene Ontology注释该基因参与免疫细胞迁移的生物学过程.CCL-C5a基因在鲤10个组织中表达,其中在脾和肝的表达量最高.脂多糖刺激鲤外周血白细胞和头肾白细胞后,该基因表达量出现显著上升.氨基酸序列保守性分析表明,鲤CCL-C5a样趋化因子与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为61％,与蓝鲶(Ictalurus futrcatus)、沟鲶(Ictalurusp unctatus)和大西洋鲑(Salmo salar)的同源性分别为47％、47％和42％;与人(Homo sapiens)CCL19蛋白的同源性为37％.适应性进化分析发现,鲤与斑马鱼CCL-C5a的Ka/Ks小于1,说明CCL-C5a基因在鱼类的进化过程受到负选择压作用.本研究结果表明,鲤CCL-C5a主要在免疫器官上高表达,并受到脂多糖诱导表达上升;同时该基因在鱼类中受到负选择作用.这些结果提示CCL-C5a可能是一个与免疫相关的基因.     

Oligosaccharide and peptidoglycan of Ganoderma lucidum activate the immune response in human mononuclear cells

The acid-hydrolyzed fragments of Ganoderma lucidum polysaccharides (GLPS) obtained by Smith degradation were separated by size-exclusion chromatography into two major water-soluble fractions: peptidoglycans (GLPS-SF1) and oligosaccharides (GLPS-SF2). Both fractions induced CD69 in human peripheral blood mononuclear cells (hPB-MNCs), and they displayed distinct immunomodulating properties. GLPS-SF1, with a molecular weight of around 20 kDa, were heterogeneous peptidoglycans composed of glucose/mannose (4:1) that exhibited biological activities with Th1 cytokines IL-12, IL-2, TNF-α, and IFN-γ in hPB-MNCs and stimulated macrophage cytokine expression via Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling. For GLPS-SF2, with a molecular weight of around several kilodaltons, its sugar sequence was elucidated by mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy as [-α-1,4-Glc-(β-1,4-GlcA)(3)-](n). This oligosaccharide displayed specific immune property with low monocyte induction, greatly stimulated cell activation and proliferation of NK and T cells. This oligosaccharide isolated from G. lucidum polysaccharides with internal glucuronic acids/glucose repeat unit in a 3:1 ratio may be responsible for the active stimulation of NK and T cells.     

Isolation, structure characterization, and immunomodulating activity of a hyperbranched polysaccharide from the fruiting bodies of Ganoderma sinense

A polysaccharide (GSP-6B) with a molecular mass of 1.86 × 10? Da was isolated from the fruiting bodies of Ganoderma sinense . Chemical composition analysis, methylation analysis, infrared spectroscopy, and nuclear magnetic resonance spectroscopy were conducted to elucidate its structure. GSP-6B contains a backbone of (1→6)-linked-β-D-glucopyranosyl residues, bearing branches at the O-3 position of every two sugar residues along the backbone. The side chains contain (1→4)-linked-β-D-glucopyranosyl residues, (1→3)-linked-β-D-glucopyranosyl residues, and nonreducing end β-D-glucopyranosyl residues. An in vitro immunomodulating activity assay revealed that GSP-6B could significantly induce the release of IL-1β and TNF-α in human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and showed no toxicity to either PBMC or a human macrophage cell line THP-1. GSP-6B could also activate dendritic cells (DC) by stimulating the secretion of IL-12 and IL-10 from DC.     

Anti-inflammatory and antifibrotic effects of naringenin in diabetic mice

Renal protective effects of naringenin at 0.5, 1, and 2% of the diet in diabetic mice were examined. Naringenin supplemented at 1 and 2% increased its deposit in liver and kidney of diabetic mice. Compared with the diabetic control group, naringenin treatments at 1 and 2% lowered plasma levels of glucose and blood urea nitrogen, as well as increased insulin level and creatinine clearance (P < 0.05). Naringenin treatments dose-dependently reduced renal tumor necrosis factor-α level and expression (P < 0.05) but only at 1 and 2% significantly decreased production and expression of interleukin (IL)-1β, IL-6, and monocyte chemoattractant protein-1 (P < 0.05). Naringenin intake at 2% decreased renal formation and expression of type IV collagen, fibronectin, and transforming growth factor-β1 (P < 0.05). This compound at 1 and 2% lowered protein kinase C activity and suppressed nuclear factor κB (NF-κB) p65 activity, mRNA expression, and protein production in kidney. However, this agent only at 2% diminished NF-κB p50 activity, mRNA expression, and protein production (P < 0.05). These results indicate that naringenin could attenuate diabetic nephropathy via its anti-inflammatory and antifibrotic activities.     

杀毙灵对三种鱼苗急性毒性试验的初步探讨

在室内常温、静水条件下 ,采用换水生物试验法 ,以杀毙灵对巴西鲷、建鲤、白鲢三种鱼苗进行急性毒性试验。结果表明 :杀毙灵对巴西鲷、建鲤、白鲢的安全浓度 ( m L/m3)分别为 0 .0 0 2 6、0 .0 0 36、0 .0 0 4 4。96h鱼苗对杀毙灵的耐受能力为 :白鲢 >建鲤 >巴西鲷。     

雅安藏茶茶多糖对~(60)Co-γ射线辐照损伤小鼠抗氧化和造血功能的防护作用

为探究雅安藏茶茶多糖对~(60)Co-γ射线辐射损伤小鼠抗辐射作用的影响,从雅安藏茶中提取茶多糖,用不同浓度(50、100、200 mg·kg-1·d-1)的茶多糖连续15 d灌胃小鼠,在第6天采用5Gy的~(60)Co-γ射线一次性全身辐照各组小鼠,灌胃第16天测定各组小鼠外周血细胞、肝脏组织总抗氧化能力(T-AOC)、总超强氧化物歧化酶(T-SOD)活性和总蛋白(TP)含量等指标。结果表明,与单纯辐照组相比,雅安藏茶茶多糖能显著提高辐照损伤小鼠的外周血细胞数量,极显著提高肝脏组织T-AOC、T-SOD活性和股骨骨髓DNA含量,极显著降低肝脏MDA含量,缓解了免疫器官胸腺的萎缩;且随着茶多糖浓度的增加,其抗辐射作用效果增强。综上,雅安藏茶茶多糖对~(60)Co-γ射线辐照损伤小鼠抗氧化功能和造血功能具有较强的防护作用,且具有一定的剂量效应。本研究结果为进一步深入探究茶多糖防辐射作用机理提供了新参考,也为雅安藏茶辐照保健功效研究提供了一定的理论依据。     

鲤鱼cDNA-AFLP技术反应体系的建立

将cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-amplified fragment length polymorphism）技术应用在鲤鱼基因的转录表达研究中,本文通过对cDNA-AFLP主要步骤的优化和改进,建立起鲤鱼cDNA-AFLP反应体系。结果表明,采用MseⅠ和BstYⅠ酶切鲤鱼cDNA100ng,分别处理2h和3h后,以接头浓度分别为2pmol/μL和0.2pmol/μL、T4连接酶浓度为0.12U/μL的反应体系进行连接。以稀释50倍的预扩增产物为模板、BstYⅠ和MseⅠ比例为1：4的引物配比进行选择扩增可得到稳定的扩增结果。本研究建立的cDNA-AFLP技术将为鲤鱼转录组研究建立基础和技术支持。     

In vivo anti-influenza virus activity of an immunomodulatory acidic polysaccharide isolated from Cordyceps militaris grown on germinated soybeans

An acidic polysaccharide (APS) was isolated from the extract of Cordyceps militaris grown on germinated soybeans. Analyses of sugar composition indicated that APS consisted of d-galactose, L-arabinose, D-xylose, L-rhamnose, and D-galacturonic acid. On the basis of the result of methylation analysis, APS was considered to be mainly composed of Araf-(1-->, -->5)-Araf-(1-->, -->4)-Galp-(1--> and -->4)-GalAp-(1--> residues. When the polysaccharide was intranasally administered, it decreased virus titers in the bronchoalveolar lavage fluid and the lung of mice infected with influenza A virus and increased survival rate. Furthermore, APS increased TNF-alpha and IFN-gamma levels in mice when compared with those of untreated mice. APS enhanced nitric oxide (NO) production and induced iNOS mRNA and protein expressions in RAW 264.7 murine macrophage cells. The induction of mRNA expression of cytokines including IL-1beta, IL-6, IL-10, and TNF-alpha was also observed. These results demonstrated that APS might have beneficial therapeutic effects on influenza A virus infection at least in part by modulation of the immune function of macrophages.     

氮营养对青花菜花球酚类物质及抗氧化能力的影响

采用无机基质盆栽,研究不同氮营养水平（5、10、15和20 mmol/L）对两品种青花菜花球生长、总酚、类黄酮含量及抗氧化能力的影响。结果表明,提高氮浓度水平,有利于青花菜株高、花球直径、花球鲜重和干重的增加;两品种花球的总酚含量随着氮浓度的增加呈降低的变化趋势,当供氮浓度高于10 mmol/L,总酚含量显著降低。花球中主要含有槲皮素和山萘黄素两种黄酮醇物质,而且山萘黄素含量是槲皮素的1.48倍;在低氮 （5 mmol/L）处理下,两品种花球的槲皮素含量和绿优2号的山萘黄素含量显著高于其他处理。增加供氮浓度,花球的二苯代苦味酰基（DPPH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）自由基清除率和铁还原抗氧化能力(FRAP, Ferric reducing /antioxidant power assay) 值呈下降趋势,限制了其抗氧化能力。相关性分析表明,两品种花球的FRAP值与酚类物质的正相关性显著高于DPPH自由基清除率。两品种相比较,中晚熟品种马拉松的花球直径、鲜重和干重显著高于中早熟品种绿优2号,而其总酚含量和抗氧化能力明显低于绿优2号。以上结果说明,通过氮营养水平能够调控青花菜酚类物质合成和抗氧化能力,从而为生产高营养品质的青花菜产品提供了可能的途径。     

Absorption and tissue distribution of an immunomodulatory alpha-D-glucan after oral administration of Tricholoma matsutake

Alpha-D-glucan (MPG-1) separated from Tricholoma matsutake (CM6271) has been reported to show immunomodulatory activities. In this study, the plasma concentration and tissue distribution of MPG-1 after CM6271 oral administration were investigated as part of the action mechanism analysis. When CM6271 was orally administered in a single dose to mice, MPG-1 was absorbed via the intestinal tract, appeared in plasma after 16 h, was gradually excreted from the blood, and fell to background level after 48 h. The time course analysis of MPG-1 in plasma showed the following pharmacokinetic parameters of MPG-1: tmax = 24 h; Cmax = 161.1 ng/mL; AUC(0-infinity) = 2559.7 ng x h/mL. Moreover, MPG-1 was confirmed to localize in Peyer's patches, mesenteric lymph nodes (MLN), and the spleen and to promote IL-12 p70 production and NK cell activity. These results suggest that MPG-1 stimulated the intestinal immune system through Peyer's patches; moreover, it was taken into the blood and stimulated the systemic immune system.