转Bt抗虫棉各器官毒蛋白的含量及表达

以转Bt毒蛋白基因抗虫棉（Gossypium hirsutum L.)中棉所30为实验材料，用ELISA（酶联免疫吸附测定法）测定植株Bt毒蛋白含量，研究在大田栽培条件下中棉所30不同器官中Bt毒蛋白含量及时空变化。结果表明：转Bt基因棉不同器官中的Bt毒蛋白含量存在着明显差异，叶片中的Bt毒蛋白含量远远高于蕾，花，铃，而蕾，花，铃中的含量差异不大。主茎叶片中（07－19标记）Bt毒蛋白含量在叶片展开后0－28d随叶增大而升高，28－48d含量比较稳定。果树叶中Bt毒蛋白含量的变化规律与主茎叶基本相同，种子和铃壳在花后20d时Bt毒蛋白含量最低，前期和后期差别较小。在不同生育阶段，相同发育期的叶，蕾，花，铃毒蛋白的表达并未出现明显的前期高，后期低或者峰谷现象。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry3A结构域编码区的融合

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt)毒素蛋白由3个不连续的结构域（domains)组成，其中结构域I为膜跨越区，与膜孔道形成有关，结构域Ⅱ，Ⅲ与受体结合有关。利用基因重组技术以鳞翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry1Aa与专一性有关的结构域编码区与对鞘翅目昆虫具专一活性的毒素蛋白Cry3A编码基因融合，构建成融合表达载体，为进一步构建Bt工程菌和Bt转基因植物奠定基础。     

土壤含水量、温度对Bt棉间苗叶、蕾Bt蛋白降解的影响

为了解土壤环境因子对Bt棉Bt蛋白降解的影响,为Bt棉生态风险性评价提供依据,室内采用ELISA法,研究了土壤不同含水量、温度影响下,Bt棉间苗叶、蕾Bt蛋白在土壤中的降解动态,并用指数模型对Bt蛋白降解动态进行拟合,估算了DT50和DT90。结果表明:不同含水量、温度条件下,Bt棉间苗叶和蕾Bt蛋白在取样第48 d,就降解了初始量的56.18%~93.26%,表明Bt蛋白前期在土壤中能快速降解,后期稳定下降。70%土壤持水量、35℃下Bt蛋白在前期降解最快,DT50(降解50%Bt蛋白所需时间)为12.29 d(间苗叶)和10.07d(蕾),DT90为41.06 d(间苗叶)和33.96 d(蕾)。适宜条件下,Bt蛋白在土壤中可被完全降解。土壤温度和含水量均会显著影响Bt蛋白在土壤中的降解。取样前期(32 d前)土壤温度和含水量对Bt蛋白降解有显著交互作用。温度是影响Bt蛋白降解的主要因子,同一含水量下,随温度升高,Bt蛋白降解速率加快。同一温度,100%土壤持水量条件下,Bt蛋白降解速率最慢,在较高温度(25℃和35℃),70%土壤持水量条件,Bt蛋白在前期(32 d或48 d前)降解速率显著快于50%土壤持水量条件。本研究表明,较高温度和适宜土壤含水量有利于Bt蛋白前期快速降解。     

用合成多肽为半抗原制备Bt Cry1Ab的单克隆抗体

由于Bt Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac晶体蛋白之间具有很高的同源性(82%~90%),采用常规的单抗制备方法很难制取特异性强的Bt Cry1Ab单抗,为了制备抗Bt Cry1Ab蛋白的特异性单克隆抗体(MAB),本研究从NCBI获得了Bt Cry1Ab蛋白的氨基酸序列,根据ANTHEPORT和DNAStar软件对其抗原性、亲水性和表位性分析结果选定BtCry1Ab特异性肽段进行人工合成,并将其偶联于匙孔血蓝蛋白(KLH)免疫动物,应用细胞融合技术制备了抗该肽段的杂交瘤细胞22株。通过ELISA试验从中筛选出与Bt Cry1Ab天然蛋白产生特异性反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株一株(3A10)。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1型;轻链属κ型;杂交瘤细胞株染色体数目为89~108条;用其制作的腹水对Bt Cry1Ab合成肽的反应效价为1∶1×107;对Bt Cry1Ab天然蛋白的反应效价为1∶1×104;纯化后的抗体对Bt Cry1Ab合成肽的效价为1∶1×108;对Bt Cry1Ab天然蛋白的效价为1∶2×104。抗体的相对亲和力为0.5μg/mL,对Bt Cry1Ab蛋白的最低可检测值为10ng/mL。ELISA结果显示,3A10杂交瘤细胞株所分泌的MAB能特异性识别合成肽和Bt Cry1Ab蛋白,而对同源的Cry1Ac和Cry1Aa蛋白无交叉反应;本研究所制备的Bt Cry1Ab单克隆抗体能够对常规棉和抗虫棉(Gossypium hirsutumL.)进行有效的区分,并且能特异性的识别其中的Bt Cry1Ab蛋白。     

褐飞虱中肠上皮细胞膜结合氨肽酶N在Sf9昆虫细胞内的表达

褐飞虱(Nilaparvata lugens)是中国水稻(Oryza sativa)生产中对水稻危害极为严重的农业害虫之一。随着微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringsis,Bt)的使用及转Bt杀虫基因作物的推广,对Bt不敏感的褐飞虱的防治将成为难点。当前研究表明Cry毒素与靶标昆虫中肠膜结合氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)的结合是Bt Cry毒素毒理机制中的重要步骤。本研究对褐飞虱转录组数据中获得的一个褐飞虱中肠apn基因进行全长克隆,构建Bacmid-bphAPN重组杆状病毒载体,并在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞(Sf9)中表达。经Western blot、蛋白质谱及免疫荧光定位检测证实bphAPN蛋白成功表达。细胞毒性实验结果显示表达了褐飞虱中肠APN的Sf9细胞对Cry1Ac活化蛋白不敏感。褐飞虱中肠APN的体外真核表达有助于褐飞虱中肠APN的特征分析,为开发对褐飞虱有毒性作用的新型Cry毒素提供了资料基础。     

苏云金芽孢杆菌新型杀虫蛋白vip3A基因的鉴定

VIPs(Vegetative insecticidal proteins)是已发现的一种新型的Bt杀虫蛋白,能在一定程度上克服许多害虫对Bt内毒素低敏感或不敏感的弊端.     

钠、钾离子对Bt蛋白在蒙脱石和凹凸棒土表面吸附与解吸的影响

采用静态吸附法研究了钠、钾离子对苏云金杆菌杀虫蛋白在蒙脱石和凹凸棒土表面吸附与解吸特性的影响。结果表明,添加钠、钾离子（0~2 mmol.L-1）均可提高Bt蛋白在两种矿物上的平衡吸附量,但等温吸附曲线的Langmuir方程拟合基本没受影响。添加钠离子或钾离子均能引起矿物粒子Zeta负电位升高,提示钠、钾离子通过减小矿物粒子与Bt蛋白之间斥力的方式促进了Bt蛋白吸附。在蒙脱石吸附Bt蛋白过程中添加钠、钾离子可使Bt蛋白的水解吸率升高,但解吸后的残留量变化不大;在凹凸棒土吸附Bt蛋白过程中添加钠、钾离子可使Bt蛋白的水解吸率减小,且解吸后的残留量增加。     

苏云金芽胞杆菌Bt9875杀虫晶体蛋白可诱导Caspase和Bcl-2家族参与调控HL-60细胞凋亡

研究Caspase家族与Bcl-2家族参与调控苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)Bt9875杀虫晶体蛋白对人急性髓细胞性白血病细胞HL-60的影响.本实验采用MTT法检测了杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡后的Caspase家族的活性和Caspase凋亡酶抑制剂对杀虫晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡的影响;采用Western blot检测了杀虫晶体蛋白诱导多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)降解、Bcl-2/Bax调控和细胞色素C的释放.研究结果表明,杀虫晶体蛋白作用HL-60细胞后,激活了Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,在48 h内Caspase家族抑制剂(Z-VAD-FMK)、Caspase-3抑制剂(z-DEVD-FMK)和Caspase-9抑制剂(Z-LEHD-FMK)均可显著抑制杀虫晶体蛋白诱导的细胞凋亡;杀虫晶体蛋白可明显上调促凋亡蛋白Bax的表达,同时下调抗凋亡蛋白BCl-2的表达,并观察到胞浆中细胞色素C的释放.初步证明了Bt9875杀虫晶体蛋白诱导的HL-60细胞凋亡是由Caspase家族和Bcl-2家族共同调控的,线粒体途径在诱导细胞凋亡过程中起着重要作用.     

煤矿中苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的分离及其鉴定

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种已被广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原细菌。本研究从永春天湖山矿区采集的159份样品中分离出1株Bt,光学显微镜检测发现菱形伴孢晶体。以cry1/7/9、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8、cry11和cry1I的通用引物对该Bt分离菌进行Cry毒素基因分析,利用SDS-PAGE和双向电泳-质谱法(2-dimensional electrophoresis/mass spectrometry,2-DE/MS)对Bt分离菌进行蛋白鉴定。结果表明,分离菌含有cry1基因型,经克隆、测序后可知,菌株中的cry1亚基因型与cry1Ac有极高的同源性。分离株表达的晶体蛋白约为130 k D,通过蛋白质谱分析表明,杀虫蛋白为Cry1Ac,与PCR-RFLP所得出的结果一致;通过质谱分析还鉴定出分子伴侣Gro EL、F0F1型ATP-β亚基合成酶、延伸因子Tu和丙酮酸脱氢酶。生物信息学分析结果表明,这些蛋白主要参与帮助新生肽的正确折叠、能源生产和转换,以及提高细胞的应激能力以抵御外界不良刺激。本研究从煤矿中分离鉴定出Bt菌,为发现新资源、新型杀虫蛋白基因以及利用微生物治理重金属污染提供基础资料。     

苏云金芽孢杆菌对新秀丽小杆线虫的作用

新秀丽小杆线虫是一种模式生物，能够在室内培养。本研究采用大肠杆菌饲养，获得大量虫源，通过观察该线虫对不同Bt菌株产生毒力反应的情况，筛选含有毒力的Bt菌株。经筛选获得6个菌株的伴孢晶体对新秀丽小杆线虫进行毒性比较，野生菌株Bt-010杀虫快速而持久，毒力强，作用时间大约在36h左右，测得其理想的LC50为0.498µg/ ml。初步纯化其毒性蛋白，发现其主要作用成分是大小为25 – 35 kD的蛋白。DNA Ladder检测发现在这个毒性蛋白不象化学农药一样对线虫的DNA造成损伤。