碱茅（Puccinellia tenuifolra）Put-Cu／Zn—SOD基因的克隆及在酵母中的表达

从碱茅根cDNA文库分离得到Put－Cu／Zn—SOD全长cDNA，其序列全长为2700bp，该基因的开放读码框为长615bp，所编码的蛋白由204个氨基酸组成，其预测分子量约为20．6kD、理论等电点约为5．63。Put－Cu／Zn—SOD氨基酸序列与水稻Cu／Zn-SOD序列有较高的同源性为87％。将Put-Cu／Zn—SOD基因构建到酵母表达载体pYES2，并转化至酵母（INVSc1）。对pYES2-Put-Cu／Zn—SOD转化酵母进行盐碱、氧化胁迫实验。结果表明：重组酵母的抗盐碱、氧化能力明显高于对照（pYES2转化酵母），结果显示了碱茅的Cu／Zn—SOD基因在酵母表达中，具有提高酵母抗盐碱和耐氧化能力。     

蜡样芽孢杆菌M22锰超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中的表达

实验成功地构建了毕赤酵母（Pichia pastoris）表达质粒pPICZA—Mn—sod,质粒线性化后通过电激法导入毕赤酵母GSl15，抗生素zeocin抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株。PCR鉴定及Mut^＋表型分析表明，目标基因已经重组到宿主基因组染色体上；0．5％甲醇诱导表达后，SDS—PAGE结果显示，表达蛋白的相对分子量约为23kD，活性电泳出现明显活性条带；酶活性测定显示，重组菌株SOD活性比对照提高5倍左右；氯仿-乙醇（3：5／V：V）和KCN（5mmol／L）抑制反应进一步证明，所表达的SOD为锰超氧化物歧化酶C。来源于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）M22的Mn—sod基因在毕赤酵母中得到正确表达。为研究该酶的生理功能提供了必要的物质条件。     

牛nanog基因原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛（Bos taurus）原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanDg基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109（Escherichia coli）,在不同的培养温度（25、30和37℃）和不同浓度的IPTG（0．10、0．25、0．50、1．00和2．00mmol／L）诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白。     

丘状乳杆菌中二醇脱水酶激活因子pduGH的克隆与功能鉴定

以丘状乳杆菌（Lactobacilluscollinoides）基因组DNA为模版，通过PCR方法得到二醇脱水酶激活因子基因pduGH，连接到表达载体pET30a上，得到重组质粒pET—pduGH。将此重组质粒转化到Escherichia．coliRosseta（DE3）中进行表达，重组菌株SDS—PAGE结果显示有明显的64．5ku和12．4ku两条特异性蛋白。表达的目的蛋白大多为不溶性的包涵体，经变性、复性后得到部分可溶性蛋白。在辅酶B12，ATP，Mg^2＋或Mn^2＋存在下，以Clostridiumpasteurianum甘油脱水酶为对象进行激活实验，结果证实，重组质粒pET—pduGH的表达产物具有甘油脱水酶激活活性。     

产L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

含有质粒pKD46的菌株BW25113．在L-阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白Exo、Bet和Gain，宿主菌就具有了同源重组的能力。利用λ噬菌体的Red重组系统构建了D-（＋）-乳酸脱氢酶基因（1dhA）、乙醇脱氢酶基因（adhE）双突变的大肠杆菌BW25113C工程菌株和乙酸激酶基因（ackA）单突变的大肠杆菌BW25113工程菌株。将表达牛链球菌L-乳酸脱氢酶基因（1dhL）的pSE380质粒转化到BW25113C菌株中发酵培养35h，用HLPC检测产物，尚未发现L-乳酸。     

蚯蚓（Eiseniafetida）细胞色素P450及抗氧化酶系对环境浓度苯并（a）芘的响应

以赤子爱胜蚓（Eiseniafetida）为供试生物,草甸棕壤为供试土壤,以蚯蚓微粒体细胞色素P450含量、抗氧化酶系以及谷胱甘肽转移酶活性为指标,进行了土壤中苯并（a）芘[B（a）P]暴露与酶活性的量-效关系研究。结果表明,在接近沈抚灌区实地污染状况B（a）P（0．1～2．0mg·kg-1）暴露下,第1、3、7以及第14d取样时,P450和SOD有较好的响应：SOD在第1、3d显著升高,而在第7、14d时降低;P450总体表现为低浓度B（a）P诱导下降低,高浓度下升高的趋势。CAT、POD以及GST的敏感性相对较差。比照其他4个指标,蚯蚓P450的敏感性更为优异,具有较好的应用前景。指标敏感性总体表现为：P450〉SOD〉CAT／POD〉GST。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

农杆菌介导的木薯转基因研究初报

将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。     

重金属富集植物黑麦草对Zn的响应

采用根袋土培试验研究了重金属Zn胁迫对黑麦草（Loliurn perenne L．）生长、抗氧化酶活性、游离脯氨酸含量、根系活力及锌积累的影响。结果表明，黑麦草对重金属锌有很强的抗性和耐性．即使在高锌下（16mmol Zn／kg）。黑麦草生长也未受到抑制。黑麦草地上部干重、根系千重在8mmol Zn／kg下达到最大值。分别较对照增加48．8％，52．2％;高锌处理（16mmol Zn／kg）的植株地上部千重也较对照增加11．2％。黑麦草POD活性随Zn胁迫增加，先下降，然后回升SOD活性则随锌胁迫增加而下降。随Zn胁迫增加，叶脯氨酸、根系活力先增加，然后下降。地上部、根系Zn含量随Zn胁迫增加而增加，最大值分别为746．5，521．0mg／kg DW（16mmol Zn／kg）。高锌处理下（≥4mmol／kg）Zn转运率（S／R）〉1．0。     

盐角草Cu/Zn-SOD基因的克隆及耐盐性分析

盐角草(Salicornia europaea)是一种典型的耐盐植物,为了研究盐角草Cu/Zn-SOD基因在的盐胁迫耐受中的机制,本研究利用已知植物Cu/Zn-SOD基因的保守序列设计简并引物,采用RACE技术的方法从盐角草中扩增获得Cu/Zn-SOD基因。使用生物学软件分析其氨基酸序列,并进行同源性比对。构建原核表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli),使目的蛋白在重组菌中表达,并分析了不同盐浓度并含有抗生素的液体LB培养基中菌的生长情况,IPTG诱导表达,通过测定OD600值来分析Cu/Zn-SOD基因的耐盐功能。结果通过简并引物PCR扩增和RACE技术,克隆出盐角草Cu/Zn-SOD基因。盐角草Cu/Zn-SOD基因(GenBank登录号:JQ074238.2)全长为660bp,开放阅读框长为459bp,推测编码152个氨基酸,蛋白分子量约为15.1kD,其氨基酸序列与碱蓬(Suaedasalsa)的序列相似性为96%,与黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)的序列相似性为88%。生物学软件分析表明Cu/Zn-SOD蛋白可能存在于细胞质。构建原核表达载体pET-Cu/Zn-SOD和对照pETDuet-1,转化大肠杆菌BL21中。蛋白经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE蛋白电泳检测发现表达蛋白条带大小与预期一致,说明目的蛋白成功表达。耐盐性分析表明重组菌BL21(pET-Cu/Zn-SOD)在高盐度培养基中的生长明显优于对照菌BL21(pETDuet-1),说明盐角草Cu/Zn-SOD基因可能在盐胁迫逆境中起到耐受性作用。     

水溶性石油烃组分对翡翠贻贝的毒性效应研究

在室内半静水的实验条件下,将翡翠贻贝（Pernaviridis）分别暴露于0．005、0．010、0．050、0．100mg·L-。的0#柴油水溶液（WSF）中,在污染后l、3、7、15d取样,于15d后转入清洁海水中进行7d污染释放试验,在18、22d采样。测定内脏团和外套膜丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）活性。结果表明,高剂量组（0．100、0．050mg·L^-1）暴污的翡翠贻贝内脏团和外套膜SOD活性和MDA含量变化比低剂量组（0．005mg·L^-1）显著（P〈0．01）,整个暴露过程中呈现先抑制后诱导再抑制的波动变化趋势,无明显的剂量-时间-效应关系。WSF暴露初期,内脏团组织中GSH含量和GST活性反应灵敏且受到抑制,此后受到明显诱导而升高,在暴露第7d达到最大值并显著高于空白组（P〈O．01）。外套膜各剂量组GSH含量和GST活性存在此消彼长的趋势,剂量-时间效应明显。污染解除后,4种生理指标均缓慢恢复至空白对照组水平。     

宇佐美曲霉木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

在已知宇佐美曲霉E001菌株木聚糖酶Xyn II cDNA序列（Genbank登录号为DQ114485）的基础上，合成1对引物（含 EcoR I和Sal I酶切位点），以重组质粒pUCm-T-xyn II为模板，扩增得到编码Xyn II成熟肽的cDNA片段（555 bp）。将其与表达质粒pET-28a连接，构建了重组表达质粒pET-28a-xyn II，转化E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL，获得重组工程菌B21/xyn II。经IPTG诱导表达，木聚糖酶的比酶活力最高可达35.6 U/mg。最后采用金属Ni2+螯和层析柱对所表达的木聚糖酶进行纯化，达到了电泳纯。重组表达的木聚糖酶最适温度为45℃，最适pH值为4.6。     

鸡肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)抗血清制备及组织表达特性分析

制备鸡(Gallus gallus)肝脏胆汁酸结合蛋白(L-BABP)的多克隆抗血清,并分析L-BABP的组织表达特性.利用RT-PCR扩增L-BABP基因的CDS区,构建鸡L-BABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T/L-BABP.将重组表达质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,经IPTG诱导后产生GST/L-BABP融合蛋白,利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST/L-BABP融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清.诱导得到了1个38 kD(12 kDL-BABP+26 kD GST)的融合蛋白,经间接ELISA方法测定制备的抗血清效价为1:100 000.利用此抗血清分析鸡L-BABP的组织表达特性,结果表明该基因仅在肝脏组织中特异性表达,在肾、肺、腿肌、腺胃、胸肌、心脏、脂肪、脾、回肠、肌胃、空肠和十二指肠等12种组织中没有检测到表达信号.本研究制备的高效价、高特异性的鸡L-BABP抗血清,为从蛋白水平上深入研究L-BABP的生物学功能提供了良好的基础.     

猪圆环病毒2型BF株ORF2基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR从构建的猪圆环病毒2型／(PCV2)ORF2重组质粒(pGEM-T-ORF2）中扩增出大小为593bp的ORb2基因，克隆到表达载体pET-32a，经异丙基硫代半乳糖苷诱导，成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白，分子量40kD，表达量20％左右。经Western blot检测，重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

猪三十九肽胆囊收缩素(CCK39)基因的克隆和表达

以猪十二指肠中提取的总RNA为模板，根据GenBank已发表的猪三十九肽胆囊收缩素（CCK39）基因序列设计1对特异性引物。用RT-PCR扩增CCK39基因的cDNA，纯化后克隆人pUC18载体，BamHⅠ／EcoRⅠ双酶切后插入pGEX-6P-1质粒获得原核表达载体。0．5mmol／L IPTG诱导表达并纯化产物，以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备单因子血清；用抗GST抗体和自制的抗CCK39的单因子血清Westen blot检测融合蛋白。结果表明：成功地克隆出CCK39基因的cDNA，构建的原核表达载体pGEX-CCK39成功地表达约32kD的融合蛋白，抗GST抗体和抗CCK39单因子血清能识别融合蛋白，证明获得的融合蛋白具有较好的抗原性，为制备抗CCK抗体及研究CCK的各种生理功能提供大量、低廉和抗原性较强的胆囊收缩素。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

[C8mim]Br对蚯蚓抗氧化系统的亚慢性毒性效应

以OECD标准的基质染毒法测定了离子液体溴化1-辛基-3-甲基咪唑（[Csmim]Br）对蚯蚓（Eisenia foetida）的急性毒性效应和亚慢性毒性条件下蚯蚓体内CAT、SOD、GST的活性和GSH、MDA含量的变化,以期初步分析[Csmim]Br对蚯蚓抗氧化系统的作用及其毒性作用的可能机理。结果表明,[C8mim]Br对蚯蚓的7d—LD50和14d—LD50分别为206．8mg·kg-1和159．4mg·kg-1。亚慢性暴露42d后蚯蚓体内CAT的活性受到显著抑制;SOD的活性在低浓度（1～5mg·kg-1）受到抑制,高浓度（20～40mg·kg-1）被激活;在高浓度处理组（20—40mg·kg-1）GST的活性显著高于对照。10～40mg·k-1 浓度的[C8mim]Br处理组GSH的含量显著升高,各处理组MDA含量与对照相比没有差异。推测[C8mim]Br可能通过肠道吸收进入蚯蚓体内,并诱导了蚯蚓体内抗氧化系统的反馈效应。     

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S蛋白5′端基因重组腺病毒的构建及其免疫特性

RT-PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）S蛋白基因5′端包含B、C抗原位点的1.0kb DNA片段,并与穿梭载体pShuttle-CMV连接;然后与腺病毒（Adenovirus）骨架载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌（Es-chenchia coli）BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒。该重组腺病毒质粒转染HEK293细胞并进行噬斑纯化,获得了1株含有TGEV S蛋白5′端基因的重组人复制缺陷型血清5型腺病毒rAd-TGEV-S。随后用RT-PCR和间接免疫荧光（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测目的基因的转录与表达。重组腺病毒rAd-TGEV-S在HEK293细胞连续传代9次后,病毒效价稳定,滴度平均为10^7.7TCID50／mL。动物免疫试验显示,rAd-TGEV-S可以诱导小鼠产生TGEV特异性IgG和IgA。     

应用自动诱导表达体系提高原核表达效率

自动诱导表达体系是依据T7表达菌株对于培养基中的碳源和能源的利用机制建立起来的,用于生产各种异源蛋白更加高效、便捷和经济。为提高重组蛋白在原核细胞中的表达效率,构建了以S基因抗原位点区作为目的基因的原核表达重组质粒pET-S1,并将其转化入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株。用IPTG诱导表达系统和自动诱导表达系统分别对目的蛋白进行表达。结果表明,目的蛋白最高表达量分别占菌体总蛋白的25.9 %和45.1 %,表明自动诱导表达系统可明显提高表达效率。