小金海棠S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（MxSAMS）的克隆和表达分析

从本实验室建立的小金海棠缺铁差减文库中分离出一个cDNA片段,在GenBank中发现该片段与其它植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因具有90%的同源性。利用RACE技术成功地获得小金海棠（Malus xiaojinensis）SAMS基因(MxSAMS)的cDNA全长序列（GenBank登录号：EU639408）,该基因cDNA全长1 479 bp,最大开放阅读框1 176 bp,编码392个氨基酸,酶蛋白理论分子量为42.99 kD;与其它植物的蛋白质氨基酸序列同源性在88.1%~92.6%之间。推测的MxSAMS蛋白质三级结构包含3个保守结构域和一个保守的ATP结合位点GAGDQG。Southern 杂交显示,MxSAMS基因在小金海棠基因组中是单拷贝的。半定量RT-PCR结果表明,该基因在小金海棠的根和叶中均受缺铁胁迫诱导增强表达。     

花生抗黄曲霉相关ARAhPR10基因克隆及其原核表达

花生黄曲霉污染已成为制约我国花生及花生制品出口贸易的关键因素。基于花生抗黄曲霉相关EST序列,RT-PCR法克隆花生ARAhPR10基因（gb｜EU661964.1）,开放读码框471bp,编码157个氨基酸,分子量16.9kD,等电点5.03。与已报导AhPR10（gb｜AY726607）相似性为49.3％。推导氨基酸序列含有PR10家族的高度保守“P-loop”基序（G＊GG＊G）和Betv1保守疏水结构域“GVALP PTAEK ITFET KLVEG PNGGS IGKLT LKY”,推测ARAhPR10是该花生PR10家族的新成员。其基因组扩增序列长度561bp,两个外显子间存在一个长度为87bp的内含子。原核表达ARAhPR10的融合蛋白约25kD,Ni^＋-NTA树脂亲和纯化后获得电泳单一条带。纯化的ARAhPR10融合蛋白具有体外核酸酶活性,预测其具有抗黄曲霉活性。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为ARAhPR10功能研究奠定了基础。     

芒果AP1同源基因的克隆及其生物信息学分析

我们采用RT-PCR方法克隆了2个A州同源基因全长cDNA,分别命名为MAPl—1（GenBankac—cession No．FJ529206）和MAPl—2（GenBankaccession No．FJ529207）。MAPl—1编码247个氨基酸,开放阅读框长度为741bp,蛋白质分子量为28．54kD,等电点为8．31;MAPl—2编码248个氨基酸,开放阅读框长度为744bp,蛋白质分子量为28．78kD,等电点为8．70。同源性分析表明,它们的核苷酸序列与其它木本植物A纠同源基因的一致性为72％～81％。实验分析表明,MAPl—1和MAPl—2第1至第61个氨基酸含有一个MADS盒结构域,第88至第178个为K盒结构域;两个基因均定位于细胞核,且功能位点分布存在着不同,推测这两个基因在花器官发育过程中的功能存在差异。蛋白二级结构预测显示,MAPl—1蛋白有12个α-螺旋,4个8折叠区,14个β-转角;而MAP1—2蛋白有11个α-螺旋,5个B折叠区,15个β-转角;其大多数氨基酸具有亲水性。本研究有助于进一步了解芒果的开花分子机理及成花的生物学发育阶段。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

小麦品种“良麦2号”α-醇溶蛋白基因序列分析

根据α-醇溶蛋白基因编码区两端保守区设计引物，对小麦品种“良麦2号”总DNA进行PCR扩增得到约900bp的DNA片段，对其进行克隆测序，获得3条基因序列，GenBank登录号分别为：DQ417343、DQ417344和DQ417345。其中，DQ417343和DQ417345分别为942bp和921 bp，可分别编码313和306个氨基酸残基；而DQ417344编码区长度为852bp，由于存在2个提前终止密码子，不能编码有功能的成熟蛋白，为假基因。序列比对显示这3个基因与已知α-醇溶蛋白基因有较高一致性，但在N-端重复区和多聚谷氨酰胺区存在一些差异。     

烟粉虱内共生菌groEL基因的PCR扩增与测序

烟粉虱内共生菌groEL基因编码一种 63KD的GroEL蛋白 ,属于分子伴侣cpn60家族成员 ,与烟粉虱传播植物病毒病关系密切。通过PCR对长期生活在甘蓝上的烟粉虱体内groEL基因进行了PCR扩增 ,序列测定表明其长度为 1 668bp ,编码 5 5 5个氨基酸 ,与Genebank中烟粉虱内共生菌groEL(AF1 30 4 2 1 )的核苷酸同源性为 99 82 % ,氨基酸同源性为 99 64%。     

高羊茅甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因FaGAPDH的克隆与分析

以高羊茅茎基部与叶基部的mRNA为模板,引用基于多年生黑麦草GAPDH基因序列设计的引物,进行RT-PCR分析,同时结合3＇RACE和5＇RACE方法从高羊茅中扩增出两个GAPDH基因,命名为Fa-GAPDH1（GQ480772）与FaG4PDH2（GQ480773）。两序列cDNA全长分别为1281bp和1348bp,具有完整的开放阅读框（ORF,FaGAPDHI：74～1087bp;FaGAPDH2：106～1119bp）,编码蛋白都为337个氨基酸。保守结构域功能分析表明两基因编码的蛋白质都具有典型的Rossman—NAD连接折叠和C-末端结构域。FaGAPDH1和FaGAPDH2蛋白与禾本科植物的该基因蛋白产物比较发现氨基酸序列的同源性都在90％以上,说明两基因具有高度的保守性。     

马铃薯StASR基因的生物信息学分析及基因克隆

将拟南芥AtASR基因核苷酸序列作为查询序列,在NCBI数据库中进行BLAST比对,得到马铃薯StASR基因(GenBank登录号:XM_006359742)的序列.通过生物信息学分析发现,该基因位于4号染色体上,基因长度为654 bp,编码108个氨基酸残基,其编码的蛋白质具有典型的ABA/WDS保守结构域.启动子区...     

番茄中一个LSm1蛋白同源基因LeLSm1的克隆及表达分析

从番茄品种超级大明星中克隆LSm1蛋白同源基因LeLSm1。LeLSm1基因全长cDNA共有1 038个核苷酸,包含一个387个核苷酸的编码区,以及318个核苷酸的5′非编码区和333个核苷酸的3′非编码区,编码一个含128个氨基酸的蛋白质,分子质量为14.5 ku,等电点为4.94。LeLSm1编码的氨基酸序列包含LSm1蛋白的保守功能域,与截形苜蓿、拟南芥和水稻等植物的类似LSm蛋白具有高度的同源性,在氨基酸水平上的一致性依次为82.8%、82.0%和72.1%。用PCR方法克隆了LeLSm1基因,其全长转录区共4 751 bp,其中包含5个外显子和4个内含子。Southern杂交结果显示,LeLSm1是单拷贝基因。半定量RT-PCR分析表明,LeLSm1在番茄五叶期和结果期的根、茎、叶以及花和果实中均有表达,且表达量无明显差异,是一个组成型表达基因。     

家蚕消化液35K蛋白酶基因的克隆及序列同源性分析

根据纯化的家蚕35K蛋白酶N末端氨基酸序列设计简并引物，从家蚕中肠组织cDNA库中分离并克隆该蛋白酶基因,对由DNA推测的氨基酸序列进行同源性检索。结果表明：存在于家蚕消化液中的35K蛋白酶基因长939bp，可编码313残基的多肽链，其中信息肽为22aa，活性肽为22aa，成熟的蛋白酶由269aa组成。与其他昆虫消化液的类胰凝乳蛋白酶具有同源性，是存在于家蚕消化液中的一种新发现的蛋白酶。     

一种新的精子膜蛋白sp18基因的克隆及其在E.coli 中的表达

摘要：利用sp18 mAb筛选小鼠睾丸λgt11-cDNA表达文库,命名为sp18（GenBank登录号：AF129872）的阳性克隆由 1 468 bp组成,开放阅读框（open reading frame, ORF）长约429 bp,编码142个氨基酸。起始密码ATG位于第694 bp,终止密码位于第1 122 bp,polyA位于1 245~1 250 bp。核苷酸同源性分析表明,sp18 cDNA的10~651 bp与人视神经Hr44的532~ 1 173 bp、sp18 cDNA的10~816 bp、864~1 444 bp与牛视神经Hr44的1 408~2 208 bp、2 250~2 309 bp的cDNA序列有很高的同源性, 高达98%。推测sp18基因可能是生殖系统存在的一种新基因。sp18编码蛋白的理论分子量约为15.7 kD,有8个N-糖基化位点和12个O-糖基化位点,亲水性分析表明sp18多肽是一种精子跨膜蛋白,跨膜区位于第17~33氨基酸处。将sp18 cDNA亚克隆到原核表达载体pET-30a(+),在E. coli BL21（DE3）中得到诱导表达,其表观分子量约为16.5 kD,表达量约占菌体总蛋白的32%。Western blot分析表明sp18 mAb能识别重组的sp18膜蛋白,表明重组蛋白具有免疫原性,为进一步研究sp18基因的功能打下了基础。     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白（phos-phatidylinositol transfer protein）同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（rapid amplification of cDNA ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291（GenBank登陆号：AY589690）。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区（氨基酸位点为83～103）。R291基因含有一个脂质结合保守区（Sec14p-like lipid-binding domain）,具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

水稻受稻瘟病菌诱导的转座类似蛋白新基因RIM2的分离与鉴定

以近等基因系H7R和H7S为材料，运用差别显示（DD－PCR）技术获得RMal9片段。用此片段为探针筛选cDNA文库，获得3944bp全长基因RIM2。Northern杂交华结果显示该基因在水稻抗感品系中均受稻瘟病菌的强列诱导。RIM2 ORF编码653个氨基酸，其序列与多种植物转座类似蛋白有32％－55％的同源性，其5′端约800bp与Xa21基因家庭Al，C的非编码区有82％的序列同源性。Southern杂交表明RIM2多拷贝存在与水稻基因组中。RIM2为一新的受病菌诱导的早期反应基因。     

解淀粉芽孢杆菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

本文以解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株为研究对象,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出编码TasA抑菌基因的全长DNA,并构建pGEX-4T2/TasA原核表达载体,获得TasA-GST融合表达的抑菌蛋白。测序结果表明,解淀粉芽孢杆菌YN-1TasA基因核苷酸序列全长为786bp(GenBank登录号:EU131674),编码261个氨基酸残基;同源性分析表明,它与解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens FZB42(YP_001421886)序列的同源性最高,达98%,预测蛋白分子量为31kD。SDS-PAGE分析表明,TasA基因能在大肠杆菌BL21中表达,Western印迹分析pGEX-4T2/TasA原核表达载体,检测到约57kD的TasA-GST融合外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。表达产物细胞裂解液上清经Ni柱层析,表明浓度为500mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白。进一步抑菌活性分析表明表达产物对黄瓜灰霉病病原菌检测平板上显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为今后深入研究TasA抑菌蛋白基因以及抗病转基因工程提供了参考。     

白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因（VvCS）的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄（Vitis vinifera）品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon）及霞多丽（Chardonnay）为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

嗜水气单胞菌aer毒素基因的克隆及核苷酸序列分析

以自行分离的嗜水单胞菌分离株AHCS02为研究对象,分析其产生的aer毒素基因结构.根据GenBank中aer毒素的基因序列（M16495）,设计扩增编码aer毒素成熟蛋白基因的引物,以AHCS02的基因组DNA为模板,PCR扩增出长度为1 332 bp的核苷酸片段,进行pMD18-T载体克隆.酶切鉴定后进行序列测定和分析,结果表明扩增的片段与M16495的同源性达92%,将测得的序列登录GenBank数据库,所得的序列编号为AY136943.分析推导其核苷酸编码的氨基酸序列显示：其编码443个氨基酸,为aer毒素成熟蛋白的基因,与M16495相比,氨基酸差异主要集中在422氨基酸残基至436氨基酸残基的位置上,在这个位置上共有8个氨基酸残基发生变化,其中在435和437氨基酸残基之间有一个氨基酸密码子丢失,氨基酸的同源性达95.5%.证明aer毒素基因的5＇端保守,3＇端变异较大.     

猪多潜能性维持因子5 cDNA全序列的克隆与分析

利用前期筛选出的一些与母猪妊娠相关的有价值的新候选基因,选取其中一个位于网络顶端的EST序列(CK455976),根据此EST序列设计引物,以母猪卵巢为材料提取总RNA,运用RT-PCR和RACE-PCR对其进行cDNA全序列克隆,得到多潜能性维持因子5(developmental pluripotency associated 5,DPPA5)基因cDNA全长596 bp,提交GenBank数据库,登录号为FJ436413.经序列分析发现,其中5'UTR长67 bp,3'UTR长175 bp,编码区长354 bp,编码117个氨基酸.同源性比对分析发现,该基因核苷酸序列与人、小鼠、猕猴和狗的DPPA5基因同源性分别为83%、70%、83%和80%;编码的氨基酸序列同源性分别为74%、55%、74%和69%.经生物信息学分析,预测出DPPA5的相对分子量约13.60 kD,等电点5.24,在约1～10、18～29、38～51、60～66和75～110位之间氨基酸存在亲水性区域,DPPA5蛋白主要存在于细胞膜外侧.     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

家蚕核型多角体病毒埃及株p10基因的克隆及结构特征分析*

根据BmNPVT3株中p10基因侧翼保守序列设计一对特异性引物,以家蚕核型多角体病毒埃及株(Bombyx mori nuclear polyhedrosis vinus strain Egyptian,BmNPV Eg)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增得到p10基因(GenBank登录号：AF533970)。扩增片段全长为877bp。含有1个213bp的开放阅读框(ORF)、编码70个氨基酸,推测其分子量为7．5kD。序列分析表明：与苜蓿银纹夜蛾(Autographa califoraica)核型多角体病毒(AcMNPV)p10基因及张耀洲得到的BmNPVp10基因相比,BmNPV埃及株及BmNPVT3株的p10基因由于在ORF的第209nt后缺失了1个dATP,从而导致他们的编码区减少了24个氨基酸残基。与BmNPVT3p10相比,BmNPVEgp10又缺失了终止密码子TAA后66～67nt的1个10bp的序列,其中包括poly(A)信号序列。