睾丸特异蛋白Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用,利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法.设计并合成了TSPY雄性特异和雌、雄共有基因引物,并利用已知性别的奶牛血液DNA为模板,初步建立了性别鉴定的PCR反应体系和非电泳的性别鉴定方法.灵敏度试验结果显示,雄性特异引物和共有基因引物对在模板10～60 Pg时,其性别鉴定的准确率为100%,提示TSPY基因具备鉴定胚胎性别的可能;同时采用非电泳法和环介导的等温扩增(LAMP)法鉴定6枚胚胎的性别,两者结果完全一致;用非电泳法检测TSPY基因鉴定了43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8天的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛.结果表明.TSPY基因是一个很好的雄性特异标记,非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠.     

应用牙釉蛋白(AML)基因鉴别牛早期胚胎性别

牛牙釉蛋白（AML）基因定位于牛X染色体和Y染色体上的同源区域.实验根据牛X、Y染色体AML基因第五内含子上序列同源性只有45.1%以及X、Y染色体该区段之间存在多处碱基缺失的特点,合成了1对性别特异性引物.该引物经扩增后母牛只得到1条467 bp的来自X染色体的扩增条带,而公牛能得到1条源自X染色体的467bp片段的扩增条带和1条源自Y染色体的341 bp的扩增条带.经基因组DNA验证,该引物的公母鉴定准确率为100%,同时该对引物具有高度的牛特异性.定量分析AML基因引物的反应灵敏度,发现1次PCR（30个循环）能扩增出0.5ng的基因组DNA,2次PCR（共50个循环）能扩增出20pg的基因组DNA.将AML基因引物与SRY基因引物的反应灵敏度相比较,结果表明前者的灵敏度比后者的高8～10倍.用AML基因反应体系鉴定了26枚优质胚胎,其中24枚有扩增结果,13枚鉴定为公牛,11枚鉴定为母牛.     

睾丸特异蛋白基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定

为方便性别鉴定方法在现场应用，利用睾丸特异蛋白基因（TSPY）建立奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法。本实验首先设计并合成TSPY雄性特异引物和雌、雄共有引物并利用已知性别的奶牛血液DNA检测了利用TSPY基因鉴定胚胎性别的可能性。结果显示：雄性特异引物和共有引物对在10pg～60pg范围内性别符合率均为100%；采用非电泳的方法检测TSPY基因鉴定了49枚胚胎的性别，同时，用LAMP法对其中的6枚胚胎的性别鉴定结果进行验证，结果二者完全一致；对其中鉴定为雌性的21枚进行移植，结果9头出生的犊牛均为母牛。结果表明，TSPY基因是一个很好的雄性特异标记，非电泳检测TSPY基因对奶牛早期胚胎性别的鉴定结果准确可靠。     

应用PCR技术检测饲料中的鱼源性成分

PCR方法在动物源性饲料检测中有很好的应用前景。为了有效检测反刍动物饲料中的鱼源性成分，降低疯牛病传播风险，本研究根据鱼线粒体1DNA 6S rRNA序列设计并筛选了鱼源性特异引物，使用Qiagen公司的组织DNA提取试剂盒提取核酸。PCR特异性检测结果表明，引物NC_Fish2480/2501F/ NC_Fish2565/2586R与牛、羊、猪、鸡成分无交叉反应；灵敏性检测结果表明，该引物可以检测到0.1%的鱼源性成分。该方法的建立为饲料中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。     

RAPD技术在葡萄种质鉴定上的应用

为建立一种简单，快捷的方法以鉴定葡萄（Vitis)种质资源，对CTAB，SDS和高盐法3种DNA提取方法进行了比较。结果表明，改良的CTAB法较为适合葡萄基因组DNA的提取。通过对TaqE,Mg^2 ,dNTP，模板DNA，Primer不同浓度的优化实验以及对PCR反应程序的筛选，建立了适合葡萄基因组RAPD分析的技术体系。运用该体系对部分葡萄品种进行RAPD分析。结果表明，采用适合的引物在该体系条件下能够达到鉴定葡萄种质资源的目的，并可应用到葡萄的遗传图谱，指纹图谱及分子标记等分子生物学的研究中。     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明：CTAB法提取效果较佳。在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg^2＋．dNTP、引物、TaqDNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10μL体系中含有1μL 10×PCR bufier,Mg^2＋2．0mmol／L,dNTP100μmol／L,引物0-3μmol／L,彻DNA聚合酶0．5U和50ng模板DNA。利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物（落羽杉和墨杉）及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

巢式PCR检测无乳链球菌16SrRNA方法的建立及应用

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）引起的奶牛乳房炎主要表现为隐性型,需要通过实验室检查才能确诊。研究建立了一种特异、敏感和快速的巢式PCR方法用于检测奶样中的无乳链球菌。利用链球菌属（Sgeptococcus）16S rRNA基因的保守区设计通用引物作为链球菌属的阳性控制,在保守区内的可变区设计无乳链球菌特异的引物。研究结果表明,通过奶样中无乳链球菌的增菌培养,简便、快速提取DNA和特异性PCR反应,可以检测到奶样中1CFU／mL的无乳链球菌,可以用作牛群中无乳链球菌感染的早期流行病学调查。     

鸡γ-干扰素基因在昆虫细胞/杆状病毒载体系统中的表达

摘要：将鸡（Gallus gallus）的γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）基因亚克隆到杆状病毒转移载体pMelBacB的BamHⅠ位点上，构建真核转移载体pMelBacB-ChIFN-γ，经限制性内切酶消化、ChIFN-γ特异引物PCR鉴定和序列测定，证明目的基因正确克隆到载体的预期位点。将纯化的pMelBacB-ChIFN-γ质粒与杆状病毒DNA（Bac-N-BlueTM DNA）共转染sf9昆虫细胞，经3轮蓝斑筛选纯化，获得了重组杆状病毒rBaculovirus-ChIFN-γ。提取病毒DNA经ChIFN-γ特异引物和重组杆状病毒特异引物PCR鉴定，证明获得了纯化的重组杆状病毒，命名为rBaculovirus-ChIFN-γ。用该重组病毒接种sf9昆虫细胞，收获接种后不同时间的细胞进行SDS-PAGE,结果表明ChIFN-γ基因在昆虫细胞中获得了表达，表达的重组蛋白分子量约为19 kD。应用在大肠杆菌(Escherichia coli )原核表达系统中表达的重组蛋白制备的兔抗ChIFN-γ多克隆抗体进行Western blot分析，表明表达的重组蛋白具有抗原性。     

茄子基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的优化

为了应用ISSR分子标记对茄子(Solanum melongena L)种资源进行种质鉴定、分类及亲缘关系等方面的研究，本试验以茄子叶片为材料，探索茄子DNA的提取及ISSR反应的最佳体系。结果表明利用改良CTAB法提取DNA，可以消除茄子叶片多糖、多酚、色素等物质的干扰，得到高质量的DNA，完全符合ISSR反应需要。以茄子基因组DNA为模板，通过正交试验设计，从Taq酶、dNTP、引物、模板4种因素3个水平对茄子ISSR反应体系进行优化，建立了一套适宜于茄子的ISSR优化反应体系及程序，为进行茄子遗传多样性的研究奠定了基础。在20μL的反应体系包括：Taq酶1 U，Mg2+2. 5mmol/ L，dNTP 375μmol/ L , 引物浓度0.4μmol/ L，模板DNA 4ng，2μL 10×PCR Buffer（Mg2+）。     

Sry—PCR法快速鉴定体外培养兔胎儿成纤细胞系的性别

从怀孕17d母兔取得3个胎儿，分离培养得到3个胎儿成纤维细胞系RFF1、RFF2和RFF3。通过扩增兔sry基因核心序列片段对3个细胞系的性别进行鉴定（Sry-PCR），结果表明：RFF1和RFF3为雄笥，RFF2为雌性，进一步利用染色体核型分析法鉴定3个细胞系的性别，与Sry-PCR法的结果完全一致。因此表明本实验所用的Sry-PCR的引物、细胞基因组DNA的提取方法、PCR反应条件是合适的，可以快速准确地鉴定体外培养的兔胎儿成纤维细胞的性别。