抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

水稻PFP基因的克隆及其遗传转化

采用RT–PCR方法,成功克隆到1个与水稻苗期耐热相关的基因PFP,构建了该基因的超表达载体,通过基因枪法转化水稻品种中花17,获得9个转基因阳性植株,与对照相比,T1代转基因植株的苗期耐热性明显增强。33个代表性地方水稻品种的耐热表型与PFP基因型的相关性分析结果表明,PFP基因的基因型与品种的耐热表型存在显著的相关性。本研究中还分析了该基因在盐、4℃低温、PEG和ABA胁迫处理下的基因表达情况。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。     

水稻vdac3基因超表达载体的构建和遗传转化

以构建水稻osvdac3基因超表达载体并获得超表达的转基因水稻植株为目标,通过PCR扩增将水稻osvdac3基因的全长片段克隆到植物表达载体,构建CaMV35S∶∶osvdac3∶∶rfp植物超表达载体.并以水稻YTB品种作为其遗传转化的受体,通过农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻遗传转化.结果表明,利用该方法成功构建了水稻osvdac3基因超表达载体,在此基础上获得了多个osvdac3基因超表达的水稻植株,并使用RT-PCR技术分析了阳性植株中osvdac3基因的表达水平.该研究结果为进一步研究水稻osvdac3基因蛋白的功能奠定了基础.     

南方水稻黑条矮缩病毒S9基因RNA干涉载体的构建

[目的]构建抗南方水稻黑条矮缩病毒(Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus)的RNA干涉载体。[方法]通过PCR扩增、克隆并测序获得SBRSDV病毒S9基因的703 bp片段,与其他地方分离物S9序列的同源性高达99%,将此片段连接至p DS1301上,并对阳性克隆进行菌落PCR、酶切等验证。[结果]成功构建了可以用于转化水稻产生转基因植株的抗SBRSDV病毒的RNAi载体。[结论]利用SBRSDV病毒S9基因的部分片段构建了p DS1301-S9 RNA双链干涉载体,为创建水稻抗SBRSDV新种质奠定了基础。     

水通道蛋白基因OsPIP2;6的功能分析

【目的】分析水稻过表达OsPIP2;6在逆境胁迫条件下的表型差异,探讨水通道蛋白基因在水稻逆境应答中的作用。【方法】构建水稻水通道蛋白OsPIP2;6的过表达载体,通过农杆菌介导将其导入水稻日本晴的愈伤中,经遗传转化,阳性鉴定,得到转基因植株。通过逆境胁迫下转基因植株的表型分析来探讨OsPIP2;6的功能。【结果】Real-time PCR结果显示,OsPIP2;6受GA、ABA调控。转基因植株的OsPIP2;6表达量显著提高。正常条件下,转基因植株与野生型植株生长发育情况并无显著差异。在逆境胁迫条件下,转基因植株的耐受能力均显著强于野生型植株。【结论】过表达水稻水通道蛋白基因OsPIP2;6的转基因植株表型显示,OsPIP2;6在水稻的抗旱、抗水淹和抗盐中发挥作用。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

水稻高效RNA干涉体系的建立及其在受体激酶基因功能研究中的应用

利用RNA干涉(RNAi)技术，可以特异性的抑制真核生物体中目标基因的表达。本研究构建了适合水稻转化的RNAi诱导载体pCADS1341。为检测其有效性，使用它构建了针对GUS基因的RNAi载体，并利用基因枪转化法导入GUS基因稳定表达的转基因水稻愈伤组织。GUS染色分析结果表明该载体中RNAi诱导元件的瞬时表达可显著抑制GUS基因的表达。为探讨影响水稻中转基因诱导的RNAi效率的因素，对针对某个目标水稻基因的水稻RNAi植株进行了详细的分析。通过Southern和Northern杂交检测了T0代RNAi植株中T-DNA插入的拷贝数和目标基因的表达量，筛选出T-DNA为单拷贝插入，且目标基因的表达被高效抑制的株系。对来源于该株系的T1代植株进行了半定量RT-PCR检测，结果表明RNAi效应可以遗传给后代转基因水稻植株，但是不同个体中的RNAi效率存在差异。RNAi系统的表达量可能是决定RNAi效率的最关键因素。我们建立的高效RNAi技术体系对于水稻功能基因组学研究具有重要意义，利用这个系统我们已经构建了60多个水稻受体激酶基因的RNAi载体，系统的研究正在进行中。     

AtCS82基因T-DNA插入突变体筛选和过表达转基因植株的获得

AtCS82是拟南芥中一个功能未知的基因,推测该基因可能与种子油脂合成代谢相关。为探明AtCS82基因的功能,采用半定量RT–PCR法对AtCS82基因在拟南芥不同组织(茎、叶、花、果荚)中的表达情况进行了分析,发现其在果荚中的表达量较高,而在茎、叶、花中的表达量明显偏低,推测AtCS82基因可能参与种子发育;使用三引物法对T–DNA插入突变体进行纯合子筛选,并通过RT–PCR检测纯合子植株中AtCS82基因的表达情况,试验结果证明获得了稳定遗传的AtCS82基因沉默纯合突变体;通过构建pCAMBIA1300–35S::CS82过表达载体,并转化拟南芥哥伦比亚野生型(Col)的方式,获得了AtCS82基因的过表达转基因植株。     

水稻黑条矮缩病毒在不同抗性玉米自交系叶片内的积累研究

应用玉米粗缩病病情严重度分级标准,对已知抗性水平的抗病、中抗和感病自交系材料逐株进行病情严重度分级调查。采集不同级别病株的玉米新叶,用间接酶联免疫吸附法(Indirect enzyme-linked immunosorbentassay,ID-ELISA)检测病株叶片中水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus,RBSDV)。采用SPSS软件对O.D405光密度值进行差异显著性分析。结果显示:同一抗性水平、不同级别的玉米自交系病株叶片内的RBSDV浓度差异显著(F=237.499,P<0.01),且随病株病级加大,病毒浓度升高;而相同病级的抗病、感病和中抗玉米自交系叶片内的RBSDV浓度无显著差异(F=0.775,P=0.598);抗病自交系病株叶片中的病毒总浓度显著低于感病自交系材料。试验结果表明:玉米粗缩病病株叶片内的病毒浓度与生物学症状呈正相关,病情越重,病毒浓度越高。RBSDV一旦侵入寄主,在抗病、感病和中抗的自交系植株体内均可增殖,并运转到新生叶片。此结论为从分子水平上进一步揭示玉米抗粗缩病的机理奠定了基础。     

利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成改良小麦面粉白度的研究

【目的】通过RNAi策略抑制小麦籽粒ppo的表达,获得籽粒PPO酶活性低、白度高的转基因小麦新种质。【方法】构建了以小麦胚乳特异表达启动子1Dx5启动子驱动的籽粒ppo的RNAi载体pBAC47P-ppoIR,利用基因枪将该载体与含bar的表达载体基因枪共转化中优9507幼胚愈伤组织,获得T0转基因植株。通过分子鉴定（PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交）、酶活筛选和白度测定等方法对转基因植株及其后代株系进行筛选。【结果】获得了27株阳性T0转基因植株。转基因植株及其后代经PCR和Southern杂交检测表明,RNAi构件已经稳定整合到T1的12个株系中。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明有20株T2籽粒中ppo表达水平明显低于对照。对转基因T2灌浆期籽粒进行PPO同功酶活性分析表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。对T4籽粒的面片白度测定表明,5个株系的白度均比对照有所提高,其中2个株系效果显著。【结论】RNAi技术的表达能抑制籽粒ppo表达,降低PPO同功酶的活性,明显提高小麦面片白度,从而为小麦面粉白度的改良、品质育种提供了材料。     

外壳蛋白基因片段介导的高抗TuMV研究

为了获得对芜菁花叶病毒（TuMV）高度稳定的抗性,选取TuMV的外壳蛋白（CP）基因近3′端保守区共377 bp的核苷酸序列,构建了抗TuMV的发卡结构RNAi载体,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。转基因植株用北京地区TuMV主要流行的强致病株系BJ-C4人工接种。鉴定的8个转基因株系中有3个株系表现出对TuMV的高度抗性。定量PCR结果显示,高抗转基因株系体内几乎检测不到病毒的积累。     

葡萄MrRPV1蛋白LRR结构域的功能研究

[目的]明确葡萄霜霉病抗性蛋白(MrRPV1)LRR结构域对葡萄霜霉菌特异性识别的影响,为进一步研究葡萄与霜霉菌间的互作机理打下基础.[方法]将MrRPV1和白粉病抗性蛋白(MrRUN1)两个蛋白的LRR结构域互换,构建重组表达载体后转化至感霜霉病和白粉病的欧亚种西拉葡萄胚性愈伤组织中以获得转基因植株,并通过DNA、RNA分子水平检测和室内接种试验进行抗病性鉴定.[结果]共获得7个RGA10-8LRR阳性转基因(重组了MrRPV1蛋白LRR结构域)株系和6个RGA8-10LRR阳性转基因(重组了MrRUN蛋白LRR结构域)株系.在7个RGA10-8LRR阳性转基因株系中,仅RGA10-8-13阳性植株表现出与MrRPV1转基因苗S8-1一致的坏死斑点,肉眼观察不到白色霜霉状物,但7个阳性转基因系均未表现出明显的白粉病抗性.在6个RGA8-10LRR阳性转基因株系中,RGA8-10-3和RGA8-10-28两个株系表现出对白粉病的抗性,有35%左右的细胞表现出细胞程序性坏死(PCD);RGA8-10LRR转基因苗均不抗霜霉病.[结论]MrRPV1的LRR结构域可能介导对葡萄霜霉菌的特异性识别,而MrRUN1的LRR结构域可能介导对白粉病菌的特异性识别.     

OsCtBP-A基因过量表达和RNAi沉默对水稻根系生长和抗性的影响

为了阐明己克隆的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的功能,构建了该基因的过量表达和RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化水稻品种日本晴愈伤组织,分别获得了45个过量表达和75个RNAi 沉默T0代转基因植株,并进行了PCR和GUS染色鉴定。T1代过量表达株OsCtBP-A基因表达量明显增加,苗期根系生长增加,对水稻白叶枯病抗性无明显变化;而基因沉默株OsCtBP-A基因表达量显著下降,苗期根系发育迟缓,抗旱性明显降低,抗病性减弱。表明OsCtBP-A基因的表达可能对水稻苗期根系发育、抗旱性和抗病性具有不同程度的调控作用。     

Silencing of OsXDH reveals the role of purine metabolism in dark tolerance in rice seedlings

Xanthine dehydrogenase(XDH) is a crucial enzyme involved in purine metabolism. To evaluate the effect of XDH deficiency on rice growth during dark treatment, wild type(WT) Nipponbare(Oryza sativa L.) and two independent transgenic lines with severe RNAi suppression(xdh3 and xdh4) were used in the present experiment. Under normal growth conditions, chlorophyll levels and biomass were indistinguishable between WT and the two RNAi transgenic lines, but XDH enzyme activity and ureide levels were suppressed in XDH RNAi transgenic lines. When XDH RNAi transgenic lines were subjected to dark treatment, chlorophyll content and biomass were significantly decreased, while O_2~–· production rate and malonaldehyde(MDA) were significantly increased compared to WT. The spraying test of exogenous allantoin raised chlorophyll content and biomass and reduced O_2~–· production rate and MDA in WT and both transgenic lines, and it also simultaneously reduced differences between RNAi and WT plants caused by XDH deficiency in growth potential and anti-oxidative capacity under dark treatment. These results suggested that fully functional purine metabolism plays an important role in reducing the sensitivity of rice seedlings to dark stress.     

一种植物RNAi双元载体的构建

[目的]为利用RNAi技术研究植物基因组功能奠定基础。[方法]通过PCR技术克隆一系列RNAi双元载体所需要的元件：绿色荧光蛋白基因（gfp）、花椰菜花叶病毒启动子（CamV35S）、氨基糖苷3＇-腺苷酰基转移酶基因（aada）、胭脂碱合成酶基因终止信号（nos）,并进行组装,在双元载体质粒pCAMBIAl301的基础上构建目的载体。[结果]通过7种中间载体的构建,最后成功得到双元载体质粒pHBMT14。[结论]该载体的成功构建为以后的植物基因组功能研究提供了技术平台。     

Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance

In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene （HPT） were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type.     

超表达HPS-PHI融合蛋白增强转基因矮牵牛同化和吸收甲醛能力

最近研究证明,在叶绿体中超表达甲基营养菌固定甲醛关键酶HPS-PHI的融合蛋白(由rmpAB基因编码)是提高转基因天竺葵代谢和吸收甲醛(HCHO)的一个有效策略。以rmpAB转化模式观赏植物矮牵牛,经基因组PCR分析确认5个转基因株系,RT-PCR检测结果表明rmpAB基因在这5个株系的叶片中可以正常转录。选取3个转录水平高的株系进行Western分析,结果证明融合蛋白HPS-PHI能在这3个转基因株系的叶片中表达,表达的融合蛋白HPS-PHI有生物学活性,酶活性最高的株系(P26)是野生型的2.5倍。经检测,3个转基因株系对液体甲醛的吸收速率均高于野生型。用P26株系进行H14 CHO标记试验,结果证实融合蛋白HPS-PHI的超表达也增强矮牵牛同化HCHO的能力。在含有7、10mmol.L-1甲醛的MS培养基上,P26的生长优势很明显,气体HCHO处理也观察到类似的结果,表明转基因矮牵牛HCHO抗性增强。证明应用该策略提高转基因观赏植物代谢和吸收HCHO的能力具有可行性。