甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

玉米小分子热激蛋白ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析

植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质POB21为材料,克隆了一个CDS序列长度为477 bp的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含158个氨基酸,具有HSP20蛋白典型的ACD结构域,预测的等电点为5.36,分子量为17.746 k D,被命名为Zm HSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因,进化和亚细胞定位分析表明,此基因属CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明,高温快速诱导Zm HSP17.7基因表达,15%PEG模拟干旱胁迫不诱导该基因表达,但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源ABA也不影响该基因的表达。与野生型拟南芥相比,超表达Zm HSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的高温和干旱耐受性,说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。     

利用病毒介导基因沉默方法研究小麦抗光氧化相关基因

为了鉴定可能的小麦抗光氧化基因,利用大麦条斑病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)介导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统,对6个小偃54响应强光的基因进行了沉默表达研究。以BSMV:GFP植株为对照,分析了这些基因的减量表达植株在低温强光、DCMU、MV及H₂O₂等处理下的PSI最大光化学效率(F_v/F_m)和光合性能指数(P.I.)、MDA含量及整株生物量变化。结果显示,Ta23008和Ta92165均参与小麦对低温强光、DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta106078参与小麦对DCMU、MV和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta27787参与小麦对低温强光、DCMU和H₂O₂等胁迫的响应过程;Ta24695参与小麦对低温强光和H₂O₂胁迫的响应过程;而Ta119251仅参与小麦对DCMU的响应过程。此外,Ta23008、Ta92165、Ta106078、Ta119251四个基因被抑制表达后,其转化株系的生物量比对照显著降低,推测其可能参与调控小麦生物量的积累。     

外源过氧化氢对烟草花芽分化的影响初探

通过盆栽试验,对外源H₂O₂处理的烟草活性氧代谢及烟草花芽分化情况进行了初步研究。结果表明：（1）外源H₂O₂处理显著影响了烟草体内活性氧代谢,H₂O₂和O₂ ^-含量迅速增加;保护酶POD和CAT活性迅速被激活,SOD的激活滞后于POD和CAT。喷施H₂O₂处理的中后期H₂O₂的含量下降。（2）外源H₂O₂胁迫改变了开花基因的表达、现蕾时烟草叶片数以及花芽的发育进程。5和15d的外源H₂O₂处理明显抑制了烟草FLC基因的表达,促进了LFY基因的表达,促使烟草花发育提前。试验结果表明烟草体内活性氧平衡状态的变化影响烟草的花发育进程。     

越南槐种子萌发响应钙离子胁迫的差异表达蛋白分析

为分析钙离子胁迫下越南槐种子萌发的分子响应机制，以越南槐种子为材料，在0、50、100 mmol/L CaCl₂溶液处理下直至萌发，利用非标记定量蛋白质组学技术结合质谱鉴定和生物信息学分析越南槐种子萌发响应钙离子胁迫的差异表达蛋白。结果表明，50 mmol/L CaCl₂ vs 0 mmol/L CaCl₂比较组中，表达上调的蛋白有43个，表达下调的蛋白有42个；100 mmol/L CaCl₂ vs 0 mmol/L CaCl₂比较组中，表达上调的蛋白有44个，表达下调的蛋白有37个；100 mmol/L CaCl₂ vs 50 mmol/L CaCl₂比较组中，表达上调的蛋白有32个，表达下调的蛋白有21个。差异表达蛋白主要参与信号转导，DNA复制和转录，蛋白质合成、加工和降解，糖与能量代谢，脂代谢，次生代谢，细胞骨架及细胞壁代谢，抗氧化及防御等过程。通过高通量蛋白质组学分析，初步揭示了参与越南槐种子萌发应答钙离子胁迫的关键蛋白质...     

异源表达四季秋海棠BsRbohD基因高光下促进花色素苷合成积累

为了探究四季秋海棠BsRbohD基因的功能,本研究以异源表达四季秋海棠BsRbohD基因的‘哥伦比亚’野生型拟南芥为材料,通过最大光化学效率(F_v/F_m)、活性氧(ROS)水平、花色素苷含量及相关合成基因表达的变化来分析BsRbohD基因与花色素苷之间的关系。结果显示:四季秋海棠BsRbohD基因异源转入拟南芥后可正常表达。在对照条件下,两个过表达株系OE1、OE2的超氧阴离子(O₂·^-)产生速率和过氧化氢(H₂O₂)含量虽然略高于野生型,但F_v/F_m、花色苷含量和相关结构基因没有显著差异;高光条件下,与野生型相比,BsRbohD在OE1和OE2中显著表达,使得O₂·^-产生速率和H₂O₂含量显著增加;之后,花色素苷的含量及合成相关基因的表达响应高光而显著上调的时间显著提前、上调幅度也较野生型高。本研究的结果表明,四季秋海棠Bs...     

甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析

从甘蓝型油菜中克隆了MAPK7基因家族3个成员BnMAPK7-1、BnMAPK7-2和BnMAPK7-3的全长cDNA序列,它们最长标准mRNA分别为1593、1434和1547 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK7基因全部来自白菜,而且BnMAPK7-1/-2的是由白菜Bra03723祖先基因加倍产生的,而BnMAPK7-3则由白菜中Bra037234的祖先基因进化形成的。同时,克隆获得BnMAPK7-1/-2的启动子序列,该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达,并发现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA、SA)、信号分子(H₂O₂)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,初步证明甘蓝型油菜MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜MAPK7-1/-3基因的原核表达,并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在,为后续的研究提供了基础。     

多胺氧化酶(PAO)调控光诱导玉米中胚轴伸长的生理机制

以长中胚轴玉米自交系PH4CV为材料,在黑暗和光照两种处理条件下研究了玉米中胚轴长度与多胺氧化酶(Polyamine Oxidase, PAO)活性、H₂O₂含量、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性及木质素含量的关系。通过添加5 mmolL^-1 PAO抑制剂2-羟乙基肼(2-hydroxyethylhydrazine, 2-HEH)和5 mmolL^-1 H₂O₂清除剂N,N’-二甲基硫脲(N,N’-Dimethylthiourea, DMTU)及组织化学染色,研究了影响中胚轴伸长的H₂O₂来源及其积累部位。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,探究了光对ZmPAO基因表达的影响。结果表明,光照处理显著抑制了玉米中胚轴的伸长,同时显著增加该部位的PAO活性、H₂O₂含量、POD活性及木质素含量。相关性分析表明,玉米中胚轴长度与PAO活性、H₂O₂含量和木质素含量呈极显著负相关,与POD活性呈显著负相关;PAO活性与H₂O₂含量、POD活性和木质素含量均呈正相关。外源PAO抑制剂和H₂O₂清除剂处理试验,玉米中胚轴表皮纵切面细胞长度显微观察及中胚轴H₂O₂组织化学染色表明,PAO氧化分解多胺(Polyamines, PAs)产生的H₂O₂参与了中胚轴细胞伸长的生理调控,从而抑制了中胚轴的伸长。表达分析表明,ZmPAO基因在黑暗环境下的表达量相对稳定,光刺激0.5 h后表达量迅速升高,3 h后达到最大值,随后逐渐下降,10 h后趋于稳定。本研究表明,PAO在接受光刺激后活性升高,氧化分解PAs产生H₂O₂,从而诱导POD氧化胞壁的单木质醇并聚合为木质素,使细胞壁硬化,造成细胞伸长受阻。研究结果为进一步探讨PAO活性调控光诱导玉米中胚轴伸长的生理机制和阐明玉米中胚轴对光逆境的响应机理提供了理论依据。     

SikCDPK1基因EF-hand的定点突变、原核表达及蛋白纯化

钙依赖性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase, CDPK)通过与Ca²⁺相互作用,在植物响应各种逆境胁迫的过程中发挥重要作用,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca²⁺的关键结构。为进一步研究具有极强耐寒性的天山雪莲对逆境的响应机制,本研究采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因EF-hand基序的第435、第471、第507和第540位氨基酸分别由E(谷氨酸)突变为Q(谷氨酰胺),构建定点突变原核表达载体,转化表达菌株E. coli BL21 (DE3),使用IPTG诱导蛋白表达,利用亲和层析系统对重组蛋白进行纯化。结果显示,重组菌株能够成功表达出目的重组蛋白,重组蛋白可溶性表达量较高的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h,最后成功纯化出符合预期大小的可溶性蛋白,为进一步探究SikCDPK1中不同EF-hand基序的生物学功能提供了实验依据。     

盐胁迫条件下外源Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜K+通道的调控

研究了Ca²⁺ 对NaCl胁迫下蚕豆气孔运动及质膜K+通道的影响。结果表明,100 mmol L^-1 NaCl可明显诱导气孔开放,该现象可被10 mmol L^-1 CaCl₂ 显著抑制。为探讨盐胁迫下Ca²⁺对K⁺和Na⁺跨膜运输的调控机制,我们利用膜片钳技术记录全细胞K⁺ 电流发现,在100 mmol L^-1 NaCl胁迫下,加入10 mmol L^-1 CaCl₂胞外处理,显著抑制质膜K+内向及外向通道电流,这种抑制可被1 mmol L^-1 La³⁺ (Ca²⁺通道抑制剂)缓解。非盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 胞外处理也能显著抑制质膜内向K⁺通道,但明显激活其外向通道,加入1 mmol L^-1 La³⁺并不能被缓解。用H₂O₂专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)单细胞分析保卫细胞内H₂O₂含量变化显示,在100 mmol L^-1 NaCl盐胁迫下,10 mmol L^-1 CaCl₂ 处理明显诱导H₂O₂在保卫细胞中积累;100 mmol L^-1 NaCl和10 mmol L^-1 CaCl₂单独处理并不能诱导H₂O₂积累。推测Ca²⁺在盐胁迫下可能先诱导H₂O₂在胞内积累,进而激活质膜Ca²⁺通道,迅速提高胞内Ca²⁺浓度以抑制Na⁺通过质膜K⁺通道跨膜内流,同时调节Na⁺外流,两种效应共同作用促使气孔关闭,减少盐胁迫下水分的过度散失。上述结果将为Ca²⁺调控作物抗盐机制研究提供新的思路。     

NO与Ca2+对蚕豆保卫细胞气孔运动的互作调控

以蚕豆(Vicia faba L.)为材料研究NO和Ca²⁺对蚕豆气孔运动及质膜K⁺通道的影响。结果表明,10 mmol L^-1 Ca²⁺和100 µmol L^-1 NO供体SNP均有效抑制气孔开放,NO清除剂c-PTIO不能缓解Ca²⁺抑制气孔开放,相反胞外加入0.1 mmol L^-1 Ca²⁺可以明显加强NO对气孔开放的抑制程度,该现象可被La³⁺(Ca²⁺通道抑制剂)缓解。以膜片钳技术记录全细胞K⁺电流发现,胞外10 µmol L^-1或100 µmol L^-1 SNP均可选择性抑制蚕豆保卫细胞质膜内向K⁺通道,追加0.1 mmol L^-1 Ca²⁺可显著激活质膜外向K⁺通道,且可被La³⁺所缓解,然而0.1 mmol L^-1 Ca²⁺单独作用并不影响质膜外向K⁺通道活性。10 mmol L^-1 Ca²⁺单独处理可激活质膜外向K⁺通道,但不能被c-PTIO缓解。分别用Ca²⁺和NO专一的荧光探针Fluo-3-AM和DAF-2DA标记蚕豆保卫细胞原生质体,检测胞内Ca²⁺和NO的水平变化发现,100 µmol L^-1 SNP明显诱导胞内Ca²⁺积累,但10 mmol L^-1 Ca²⁺并不能诱导NO在细胞内积累。记录保卫细胞质膜Ca²⁺通道电流发现,NO可明显激活质膜Ca²⁺通道。表明NO有效抑制气孔开放,可能主要通过激活质膜Ca²⁺通道,提高胞内Ca²⁺,激活质膜外向K⁺通道促进K⁺外流,同时,可选择性抑制内向K⁺通道阻止K⁺内流,两种途径共同作用抑制气孔开放。然而,胞外10 mmol L^-1 Ca²⁺对气孔和质膜K⁺通道活性的调节并不依赖于NO。     

分离和鉴定油菜D型MAP激酶基因BnMPK9

为了应对不良的外界环境,植物形成了一整套复杂的信号网络体系以适应变化的外界环境。其中MAPK级联是其中一个重要而保守的信号传导系统。采用RT-PCR策略,从干旱处理的油菜cDNA中克隆出全长的细胞分裂原激活的蛋白激酶基因。该基因命名为BnMPK9(GenBank登录号为AY737714),包含一个蛋白激酶区和一个保守的CD区。该基因与拟南芥AtMPK9高度同源,其激酶的磷酸化位点为TDY,同为D型MAPK亚家族基因。Southern杂交结果表明该基因在油菜基因组中拷贝数不少于2个。Northern杂交结果显示该基因能在不同的植物组织中表达。其表达受到甘露醇、紫外线和双氧水诱导上调表达,但低温和水杨酸处理后下调表达。实时RT-PCR分析表明甘露醇和双氧水能长时间诱导该基因高表达。在根中,甘露醇也能促进其上调表达。BnMPK9连接到pYES2.1酵母表达载体中转化酵母,发现增强了酵母对600 mmol L^–1甘露醇和0.2 mmol L^-1 tBuOOH的抗性。以上结果说明BnMPK9是MAPK基因家族中的一员,涉及真核生物细胞渗透和活性氧胁迫,并增强其抗性。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

铝离子胁迫下大豆根尖柠檬酸的分泌及SGA1基因的表达

为揭示铝离子诱导大豆根尖分泌有机酸的特点及介导有机酸分泌的信号途径,采用溶液培养试验方法调查Al Cl3对大豆品种(广州本地2号)根尖有机酸分泌及SGA1基因表达的影响。结果表明,Al Cl3胁迫下大豆活体根尖分泌柠檬酸,且分泌量随着铝浓度(25、50μmol L–1Al Cl3)和处理时间(2~12 h)的增加而增加;大豆根尖以模式II分泌柠檬酸,处理后的前4 h,分泌速率很低,其后显著提升;有机酸明显分泌的诱导期长达6 h;在50μmol L–1 Al Cl3的溶液中添加异三聚体G蛋白抑制剂百日咳毒素(200 ng m L–1),柠檬酸分泌减少38.7%。RT-PCR分析结果显示,Al Cl3溶液诱导大豆根尖SGA1基因的表达,其表达水平随着铝处理时间(0.5~12.0 h)的延长有提升的趋势,而诱导的SGA1基因表达明显早于有机酸开始分泌时间(6 h)。这些结果表明,铝离子诱导大豆根尖分泌柠檬酸及SGA1基因的表达,异三聚体G蛋白可能作为铝胁迫信号开关器参与有机酸分泌的调控。     

细胞内IP3-Ca2+途径对UV-B辐射下玉米幼苗光合特性的调控机制

使用外加0.15 Wm^-2 UV-B及不同钙效应剂处理玉米幼苗,研究细胞Ca²⁺信号系统对UV-B辐射下玉米幼苗光合作用的调控机理。结果表明,UV诱导的胞内Ca²⁺荧光增强受胞内IP3通道阻断剂肝素(Heparin)、胞内CaM活性抑制剂三氟啦嗪(TFP)抑制,降低玉米幼苗Chl a、Chl b及Chl T含量、原初光能转化效率(F_v/F_m)、PSII活性(F_v/F_o)、Hill反应活力、水分利用效率(WUE),提高胞间二氧化碳浓度(C_i),最终导致净光合速率(P_n)下降;细胞质膜钙通道阻断剂氯化镧(LaCl₃)引发的此效应较小。据此提出,UV-B辐射下,玉米幼苗叶片细胞IP3动员胞内钙库释放Ca²⁺,调节光合色素合成、Hill反应活性、WUE,CaM介导的下游反应调节G_s,是Ca²⁺信号系统最终实现对P_n调控的主要机制。     

过表达谷子液泡H~+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性

V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对,从谷子中克隆到V-H+-ATPase E亚基基因Si VHA-E。进化树分析显示,Si VHA-E基因在进化上属于E1/E3亚族,与玉米V-H+-ATPase E亚基基因Zm VHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示,Si VHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(Me JA)、水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调,在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明Si VHA-E定位于液泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明,在盐处理条件下,转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比,Si VHA-E过表达植株体内Na+含量减少,体内相对含水量提高。此外,ABA萌发试验结果显示,在种子萌发后期,Si VHA-E过表达植株对ABA更加敏感。研究表明,谷子Si VHA-E可以显著提高拟南芥耐盐性,这可能与其正向调控ABA信号途径以及减少植株体内Na+积累和水分散失有关。     

氢还原竖炉的模拟分析

利用一组物料、热量守衡式及其他有关约束关系,建立了氢还原竖炉模拟模型,可定量考察消耗量、生成量和氮气、CO兑入成分、DRI金属化率、入炉煤气温度等的关系。模拟结果表明：兑入CO可使入炉煤气量从纯氢还原的1650 N·m³左右下降到1200 N·m³左右;当CO和H₂的体积之比V（CO）/V（H₂）约为0.6时,氮气兑入量约为0,竖炉能量利用最佳;当V（CO）/V（H₂）体积比为0.3时,最佳氮气兑入成分约为11%;纯氢还原最佳氮气兑入成分约为25%;兑入氮气可以减少入炉氢气的量,但不能减少入炉气体的总量。对氢还原竖炉模拟结果可为其工艺设计、操作和节能等提供参考信息。     

CuFe2O4纳米粒子增敏Luminol-EDTA化学发光体系研究及应用

基于CuFe₂O₄纳米粒子能显著增强Luminol-EDTA体系的发光，首次建立了Luminol-EDTA-CuFe₂O₄ NPs化学发光新体系。紫外吸收光谱和化学发光光谱表明纳米CuFe₂O₄注入Luminol-EDTA体系后，未生成新发光物质，结合纳米CuFe₂O₄的特性，提出了CuFe₂O₄ NPs参与Luminol-EDTA体系可能的发光机理。研究发现芦丁能抑制Luminol-EDTA-CuFe₂O₄ NPs体系的化学发光，结合流动注射技术，将此化学发光体系应用于芦丁片中芦丁含量的测定。在优化实验条件下，芦丁浓度在2×10^-8~2×10^-5 mol/L范围内芦丁浓度的对数和相对化学发光值呈线性，芦丁浓度检出限（LOD）为1.21×10^-9 mol/L。将本方法应用于芦丁片中的芦丁含量测定，回收率为97%~102%，RSD为2.54%（c=1×10^-7mol/L，n=11）。