防治禽流感8项国家标准发布

由国家标准化管理委员会组织农业部等相关部门研制的防治禽流感8项国家标准开始正式实施。这8项国家标准分别是:禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法、H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法、H7亚型禽流感病毒荧光RT-RCR检测方法、H9亚型禽流感病毒荧光RT-PRC检测方法、H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法、禽流感病毒NASBA检测方法、进出境禽鸟及其产品高致病性禽流感检疫规范和高致病性禽流感防治技术规范,其中前六项是推荐性国家标准,后两项是强制性国家标准。(摘自人民日报)防治禽流感8项国家标准发布…     

防治禽流感8项国家标准发布

由国家标准化管理委员会组织农业部等相关部门研制的防治禽流感8项国家标准开始正式实施。这8项国家标准分别是：禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法、H5亚型禽流感病毒荧光RT—PCR检测方法、H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法、H9亚型禽流感病毒荧光RT—PRC检测     

2022年河南省禽流感专项监测评估报告

为监测河南省高致病性禽流感免疫抗体和野毒感染情况,笔者按照《河南省2022年动物疫病监测与流行病学调查计划》的要求,采用HI试验检测禽流感免疫抗体,采用荧光RT-PCR方法检测病毒核酸,在全省开展禽流感专项监测工作。结果表明,河南省高致病性禽流感免疫抗体群体合格率为93.2%,禽流感H5亚型平均个体抗体合格率为94.04%,H7N9亚型平均个体抗体合格率为96.32%。不同地区的禽流感H5亚型和H7N9亚型免疫抗体合格率均>90%,种禽场、商品代场和屠宰场采集的血清样本免疫抗体合格率均在92%以上。未检出H5亚型和H7亚型禽流感病毒核酸。共检出76份禽流感病毒H9亚型阳性样本,阳性率为2.07%。结果表明,河南省高致病性禽流感整体防控效果良好,免疫抗体水平均高于国家标准;未检出高致病性禽流感病毒,但有低致病性禽流感感染的现象。本次调查将为河南省进一步做好禽流感防控工作提供数据支撑。     

广西玉林市规模化禽场禽流感病毒检测

为了解广西玉林市2020年规模禽场禽流感病毒感染状况,采用荧光RT-PCR方法,对广西玉林市7个县(市、区)42个规模化禽场采集的1260份禽喉/泄殖腔棉拭子样品进行了通用型禽流感病毒核酸检测(荧光PCR),并对检测为阳性的样本进行H5、H7亚型(双重荧光PCR)和H9亚型(荧光PCR)分型鉴定。结果显示:在42个规模化禽场中,未检出H5和H7亚型高致病性禽流感病毒阳性样品;在2个鸡场中检出18份H9亚型低致病性禽流感病毒阳性样品,在2个鸡场和4个鸭场中检出115份其他亚型低致病性禽流感病毒阳性样品。结果表明:在高致病性禽流感(H5+H7)三价灭活疫苗强制免疫政策下,广西玉林市规模化禽场的高致病性禽流感病毒感染风险较小,但仍须加强禽流感的免疫、监测,做好综合防控,以降低禽流感病毒由低致病性重组变异为高致病性的风险。本检测为指导广西玉林市禽流感防控提供了依据。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。     

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10~(-4) ng/μL(1.30×10~4 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。     

2022年青海湖野鸟禽流感疫情监测及分析

2022年7月青海湖国家级自然保护区周边部分湿地内发现候鸟棕头鸥异常死亡,采样并经实时荧光定量RT-PCR方法检测诊断其死因为疑似H5亚型高致病性禽流感感染所致,国家禽流感参考实验室对病毒进行了分离培养,确诊候鸟因感染H5N1亚型高致病性禽流感而死亡。     

应用三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸

为了验证三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸的可行性,应用建立的方法分别检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒抗原,验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的方法检测临床样品。结果为,三重荧光RT-PCR方法能分别特异检出H5、H7和H9亚型禽流感病毒抗原。最低的检出限为H5亚型禽流感抗原(Re-11株)10-7的稀释度,变异系数(CV)为1.25%。检测100份鸡喉拭子,H5、H7亚型禽流感病毒核酸均为阴性,H9亚型禽流感病毒核酸13份阳性,阳性率为13.00%。结果表明,建立的三重荧光RT-PCR方法通过一个反应体系可以检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸、具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

H5N8亚型禽流感病毒HA和NA基因双重荧光RT-PCR检测方法的建立

H5N8亚型禽流感是传播性极强的人兽共患病,为了简便快速的检测H5N8亚型禽流感病毒,针对H5N8亚型禽流感病毒HA基因和NA基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了同一反应程序下同时扩增HA基因和NA基因的双重荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该检测方法特异性强,不与其他亚型禽流感病毒和禽常见病原发生交叉反应,敏感性可达10copies/μL;组内组间重复性好,平均变异系数均小于0.4%;用该方法对108份临床样品检测,结果与病毒分离鉴定方法检出率一致。综上所述,建立的H5N8亚型禽流感病毒双重荧光RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,为H5N8亚型禽流感的快速诊断和疫情防控提供了一定的技术支持。     

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性,应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性,检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原,并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法,H7体系能检测出1:10-10抗原稀释度,N9体系能检测1:10-9抗原稀释度,对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应;检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明,荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法的建立

为建立一种特异、灵敏、简便、快速的禽流感病毒H5亚型的检测方法,根据近几年流行的禽流感病毒H5亚型毒株HA基因序列,采用DNAStar生物分析软件进行基因序列比对后,选择相对保守区域,设计多对引物及探针,建立了禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法,对该方法的反应条件进行优化并检测特异性和灵敏性。结果显示,建立的检测禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA方法特异性强,只有禽流感病毒H5亚型呈阳性,其他均为阴性;灵敏性较高,最低可检测到质量浓度为0.89×10-3 mg/L的禽流感病毒H5亚型核酸,比实时荧光RT-PCR方法灵敏性低10倍;检测快速,检测反应所需时间仅20min,比实时荧光RT-PCR方法缩短近1h。结果表明,所建立的禽流感病毒H5亚型RT-exoRPA检测方法适应于禽流感病毒H5亚型的现场检测,以及基层实验室的推广应用。     

供港澳家禽高致病性禽流感及H7N9病毒监测与分析

采集供港澳家禽喉头、泄殖腔拭子进行禽流感病毒监测,建立一步法荧光RT-PCR检测A型和H5、H7、H9亚型及H7N9病毒,所用高通量核酸提取和基因扩增体系可适应活禽出口快速检测通关的要求。2006—2015年共检测约150万份拭子,结果 H5和H7亚型高致病性禽流感全部为阴性,H9亚型等A型流感病毒阳性率约0.035%,冬、春季节检出率较高,H9亚型病毒HA基因与H7N9病毒广东流行毒株具有亲缘关系。供港澳禽流感病毒监测体系快速高效、生物安全性好,结合抗体监测和临床检查,可保证出口家禽处于无禽流感状态。     

禽流感病毒多重荧光RT-PCR检测技术的建立与初步应用

国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离,该方法是O IE推荐的方法,但是耗费时间长。为缩短检测时间,目前我们已成功建立了灵敏、特异的荧光RT-PCR检测方法,并已经应用于活禽、禽组织及环境中禽流感病毒的快速检测与H 5、H 7、H 9亚型的分型鉴定。鉴于我国2004年年初暴发H 5N 1亚型禽流感疫情,以及高致病力禽流感通常由H 5和H 7亚型引起,因此在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要,在本研究中,为能进一步提高检测效率,节约成本,我们进一步研制开发的H 5/H 7和H 5/N 1多重荧光PCR…     

鹅禽流感、副黏病毒病的免疫效果评估及病原学调查研究

通过对产蛋前种鹅、产蛋期种鹅及60日龄商品肉鹅的血清样品进行H5亚型高致病性禽流感和副黏病毒病免疫抗体检测,以及连续3年的H5亚型高致病性禽流感和副黏病毒病病原学检测,结果显示H5亚型高致病性禽流感和副黏病毒病免疫抗体水平较高;无H5亚型高致病性禽流感和副黏病毒病阳性病毒核酸样品检出,说明该场无发生H5亚型高致病性禽流感和副黏病毒病的疫情风险。     

H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用

H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化。以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100%、98%、98%。敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1 fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍。结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断。     

2014年全球禽流感流行状况

本文对2014年全球禽流感的发生情况进行了介绍,并分析了其流行特点。H5N1亚型高致病性禽流感疫情持续在东南亚暴发流行,造成严重的损失;H5N8亚型高致病性禽流感病毒首次在日韩以及德荷英等国家出现,引发全球广泛关注;H5N2、H5N3和H5N6等3种亚型高致病性禽流感病毒引发的疫情也对发病国家造成巨大损失;H5N2、H7N1等多种亚型低致病性禽流感病毒的共存,对禽流感防控形成了更加严峻的挑战。     

山东省青岛市2015年禽流感监测分析

[目的]调查青岛市家禽高致病性禽流感免疫水平,测定该地区的禽流感流行率,分析流行的风险因素。[方法]在全市家禽养殖场（户）、农贸市场、屠宰场和野鸟栖息地随机抽样,采用血凝抑制方法测抗体,采用荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病原,同时开展禽流感血清学和病原学检测。利用GIS、EXCEL软件,分析青岛市禽流感检测样品的空间分布、免疫抗体水平、病原流行率及分布。[结果]青岛市家禽H5N1禽流感（Re-6）免疫抗体场户合格率为76.3%,个体合格率为74.8%;H5N1禽流感（Re-7）免疫抗体场户合格率为72.5%,个体合格率为71.4%;H5亚型禽流感病原学检测全部阴性;H9亚型禽流感个体流行率为1.18%,全部来源于农贸市场和屠宰场。[结论]青岛市家禽高致病性禽流感的免疫状况良好,在所有家禽和野禽活动场点未发现高致病性禽流感病毒,表明青岛市高致病性禽流感防控效果较好。     

禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验

为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度，通过测定已知鸡胚半数致死量（ELD50）的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚，对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量（ELD50）的测定，结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-7.75/0．2mL，H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10^-8.5／0．2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释，进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定，结果发现：试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-5倍稀释液，该稀释液含有281ELD50病毒量；检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10^-8倍稀释液，该稀释液含有15．8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时，试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和（或）泄殖腔拭子所采集的病毒量，能够满足检验检疫的实际需要。     

H5和H7亚型高致病性禽流感病毒新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立鉴别检测H5和H7亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)双重荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据已登录的H5和H7亚型HPAIV HA基因裂解位点序列差异分别设计引物和探针,对反应体系各条件优化后首次建立了同时鉴别检测H5与H7亚型HPAIV的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR方法。特异性试验结果显示,该方法除对H5和H7亚型HPAIV检测结果为阳性外,对其它几种常见的禽病病原检测结果均为阴性,该方法特异性强;敏感性试验结果显示,该方法检测下限为病毒浓度1×10~1TCID_(50)/mL,而常规荧光定量RT-PCR检测下限为1×10~2TCID_(50)/mL,敏感性高;标准曲线分析后结果显示,本研究所建立方法的扩增效率比常规荧光定量RT-PCR高,二者相关系数均为0.997;批内和批间重复性试验结果显示,Ct值的变异系数均小于2%以下,重复性高。临床样品检测结果显示,该方法所需样本微量仅为1μL～2μL;操作简便、快速,检测过程40 min,可用于现场检测;而且利用该方法与常规荧光定量PCR方法以及测序对临床样品进行检测,三者结果完全吻合。本研究所建立的新型冻干微芯片双重荧光定量RT-PCR检测方法为H5和H7亚型HPAIV监测和临床检测提供了可行的技术手段。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。