人源福氏志贺菌对鸡肠上皮原代细胞侵袭特性研究

为研究人源福氏志贺菌对鸡肠上皮原代细胞侵袭力和侵袭特性,进一步验证人源志贺菌对鸡的致病性并建立体外研究模型,采用Hela细胞庆大霉素保护试验和免疫组织化学染色检测分离的人源福氏志贺菌ZD02株的毒力。然后采用细胞免疫组织化学染色研究ZD02株对鸡肠上皮细胞的侵袭力和相关侵袭特性。人源福氏志贺菌ZD02株能够侵入Hela细胞,庆大霉素保护试验结果显示,感染后30、60、90、120min时ZD02株侵袭率分别为1.43%、2.43%、2.56%、2.62%,证明ZD02株具有毒力。ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞免疫组织化学检测结果显示,ZD02株能侵入鸡肠上皮细胞,感染后1、2、3、4h时ZD02株侵袭率分别为1.7%、6.2%、8.0%、11.2%。鸡肠上皮原代细胞经EGTA处理后,ZD02株侵袭率显著提高。人源福氏志贺菌ZD02株对鸡肠上皮细胞具有侵袭力,且从肠上皮细胞基底侧部侵袭。本研究进一步验证了志贺菌人禽互传的可能性,鸡肠上皮原代细胞可作为研究志贺菌致病机理的体外模型。     

利用免疫沉淀法对鸡源志贺菌IpaC蛋白受体候选蛋白的初步筛选

为筛选鸡源志贺菌IpaC蛋白的受体。利用生物素标记试剂盒标记IpaC蛋白,分离培养原代鸡肠上皮细胞和。利用ProteoExtract?天然膜蛋白提取试剂盒提取鸡肠上皮细胞的膜蛋白;应用免疫沉淀、免疫磁珠法分离富集与IpaC蛋白结合的蛋白质;利用SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。结果获得了与IpaC蛋白特异性结合的大约在34 000~55 000之间的蛋白条带。筛选得到的SDS-PAGE蛋白条带进行LC-MS/MS测序鉴定和生物信息学分析。初步将annexin A2,37 000Laminin receptor precursor,LIM and SH3protein 1,ras-related protein Rab-43作为IpaC蛋白受体的候选蛋白。为研究志贺菌在鸡体内的致病机制奠定基础,而且可以为评估鸡源志贺菌在公共卫生方面的重要性提供参考依据。     

鸡源志贺菌16SrRNA基因克隆、测序及同源性分析

目的:建立鸡源志贺菌的16SrDNA序列分析方法从而进一步从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌。方法:用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌16SrRNA的部分基因(16SrDNA)并测序,将所获得的序列与GenBank中人志贺菌序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。结果:首次研究发现鸡源志贺菌的16SrDNA序列与已知的人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99·7%,与人福氏志贺菌的同源性为96·0%。结论:16SrDNA序列分析鉴定志贺菌是一种快速、可靠的方法。     

鸡源志贺菌IpaC蛋白单抗制备及其受体的初步鉴定

为制备特异性的鸡源志贺菌IpaC蛋白单克隆抗体和鉴定其受体,以纯化的重组鸡源志贺菌IpaC蛋白制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA分析表明重组IpaC蛋白具有很好的免疫反应原性。将纯化的IpaC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。经过杂交瘤细胞阳性孔的筛选、单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亚型鉴定、单克隆抗体Western blot鉴定后,获得1株杂交瘤阳性细胞5A12B5。同时,通过鸡胚肠组织提取总蛋白,利用铺覆蛋白印迹技术,初步测定IpaC蛋白受体相对分子质量约为55 000。试验为IpaC蛋白检测和该蛋白与鸡肠上皮细胞之间的相互作用研究奠定基础,同时也为评估鸡源志贺菌在公共卫生等方面的重要性提供参考依据。     

16S rRNA基因联合gyrB、grpE、recA基因对鸡源鲍氏志贺菌hn03株进行分子起源分析

为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16srRNA、gyrB、grpE、recA4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与GenBank中同源性较高的相关序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。研究发现,从4基因的序列分析结果总体上可知鸡源志贺菌与人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99．6％～100％。几乎所有志贺菌均落入大肠杆菌的分支中,且在鉴别细菌中recA基因和gyrB基因比传统中常用的16S rRNA基因差异更显著。由此证明用细菌分类和鉴定的“金标准”16S rRNA联合gyrB、grpE、recA3个基因进行序列分析来鉴定志贺菌是一种可靠、成本较低的方法;由上述基因序列构建的系统发育树提示,该株鸡源志贺菌可能是与人志贺菌密切相关的新种或是它们的亚种。     

单核细胞增生李斯特菌NTSNΔ0287缺失株的构建及其生物学特性

内化素蛋白家族是一类重要的表面蛋白,其与单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的黏附侵袭作用密切相关。Lm NTSN_0287基因编码含有信号肽序列和LRR重复结构域的内化素家族蛋白,其作用机制有待于阐明。通过荧光定量PCR的方法,发现该基因在Lm侵袭Caco-2细胞时上调表达,达到体外表达量的1 300倍。为明确该基因的生物学特性,研究利用同源重组技术构建了LmNTSNΔ0287缺失株。与野生株相比,NTSNΔ0287缺失株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力均显著降低,对HeLa细胞的黏附能力下降,侵袭能力增加。经口服和尾静脉途径接种BALB/c小鼠,NTSNΔ0287缺失株在脾脏和肝脏中的载菌量均降低,但其LD_(50)与野生株相比无明显差异。因BALB/c小鼠缺乏人所特有的细胞表面内化素受体E-cad,并不是最佳实验动物模型,下一步将选用同时具有内化素受体E-cad和Met的沙鼠做进一步研究。     

鸡源鲍氏志贺菌hn03株的分子鉴定与演化分析

以鸡源鲍氏志贺菌为研究对象,根据GenBank中收录的相应序列针对8个看家基因thrB/thrC、trpC/tr-pB、purM/purN、mdh/argR设计相应引物,分别扩增出8个目的基因,然后克隆到pMD18-T vector,进一步测定序列,并将序列测定结果登陆GenBank。利用BLAST和ClustalX程序分析测序结果,构建了8个看家基因在染色体上4个区域的相应遗传进化树。由构建的系统进化树可知：志贺菌分为3个主要分支,且均落在大肠杆菌中,本研究中的分离菌株鸡源鲍氏志贺菌在染色体上4个区域的进化树中分布位置一致,均落在志贺菌3个主要分支中的第一分支;从整个基因水平上看,鸡源鲍氏志贺分离株应起源于人源志贺菌。     

肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因缺失株的毒力相关功能研究

为研究肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因在肠炎沙门菌感染中的毒力作用,利用Red同源重组系统对2株肠炎沙门菌(国内标准株50336和国际参考株SD-2)SPI-19的Hcp基因进行敲除,成功构建了50336ΔHcp和SD-2ΔHcp基因缺失株,并构建了回补株50336ΔHcp/pHcp和SD-2ΔHcp/pHcp。分析比较缺失株与野生株对人肠上皮细胞系Caco-2黏附和侵袭能力,以及在鸡巨噬细胞HD11的存活能力。结果显示:缺失Hcp基因后,肠炎沙门菌50336对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降39.1%和47.9%;SD-2对Caco-2细胞黏附和侵袭数量分别下降46.5%和58.9%。吞噬作用2h后,50336ΔHcp和SD-2ΔHcp与野生株相比在HD11的存活量下降了35.7%和37.2%,差异显著。通过Real Time-PCR试验分析,与野生株相比,Hcp基因缺失后fliC、sefA、ompA,ompC这4个重要粘附因子编码基因的表达量显著下降。试验表明,肠炎沙门菌SPI-19编码的Hcp基因对肠炎沙门菌的毒力具有增强作用。     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

树鼩源大肠埃希氏菌耐药性分析与毒力因子鉴定

为了解树鼩源大肠埃希氏菌遗传进化同源性、对药物的敏感性以及所携带的毒力因子种类等,对广西南宁某大学人工驯化养殖的10只树鼩肠道内容物进行大肠埃希氏菌的分离纯化、生化分析及药敏试验等,并应用PCR技术对菌株进行16S rRNA同源性分析、毒力基因及耐药基因的检测。10份树鼩肠道内容物经分离纯化共分离出9株大肠埃希氏菌。同源性分析表明分离株与鸡源、猪源、人源大肠埃希氏菌之间的亲缘性较近,存在跨种间传播风险。药敏试验表明,分离株对苯唑西林耐药率为88.8%,对氨苄西林耐药率77.8%,对四环素、多西环素耐药率均为44.4%,对头孢哌酮、头孢他啶、卡那霉素、庆大霉素等表现为高度或中度敏感。共扩增出4种耐药基因,分别为四环素类耐药基因tetA、tetB,检出率均为100%,β-内酰胺类耐药基因TEM检出率为100%,CTX-M检出率为44.4%。毒力因子仅检测出eaeA基因,检出率为100%。表明分离株与其他动物源性大肠埃希氏菌亲缘性较近,具有一定耐药性,并携带毒力基因,存在一定的致病风险。     

重复使用细胞培养板对细胞培养的影响

在生物制品检验过程中,有很多因素能影响产品的检验结果,导致检验结果不能正确反映出被检验产品的质量。 目前在病毒含量测定中,使用的培养器材为一次性细胞培养板。在工作中,我们首先要考虑工作质量,但同时也要考虑节约问题,最理想的结果是既能正确反映出产品的质量,又能达到节约材料的目的。鉴于这种情况,我们作了重复使用培养板(一次性细胞培养板)的试验,具体试验方法及结果如下。     

哺乳动物体细胞核移植中供体细胞的研究进展

本文对哺乳动物核移植供体细胞的研究进展进行了综述。主要涉及细胞类型、细胞年龄和细胞所处的周期时相对核移植胚胎发育的影响，以及目前核移植技术存在的问题等。     

不同细胞培养基细胞培养动力学比较试验

应用宜兴赛尔生物化工厂产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基与美国Ｓｉｇｍａ公司产１９９、Ｆ－１０、１６４０和ＤＭＥＭ细胞培养基分别配制细胞培养液，培养ＳＰ２／０和Ｖｅｒｏ细胞系及原代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），做细胞培养动力学比较试验。比较这两种来源的细胞培养基对细胞生长的形态、分裂速度及鸡马立克氏病毒（Ｍａｒｅｋ＇ｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ．ＭＤＶ）疫苗毒株ＨＶＴ－ＦＣ１２６和ＲｉｓｐｅｎｓＣＶＩ９８８在ＣＥＦ单层上增殖量的差异。研究结果表明，四种国产细胞培养基与对应的四种进口培养基对细胞生长及病毒增殖的影响无显著差异     

NKT细胞研究进展

NKT细胞属于新发现的一类淋巴细胞 ,此类淋巴细胞不同于 NK细胞和 T细胞。新近在 NKT细胞发育、细胞表型、抗原识别及其在免疫调节中的作用等方面取得了很大进展。研究发现 ,NKT细胞表型为 Vα1 4 。 CD1 1 c CD1 1 b DC或 CD1 1 c CD1 1 b- DC可能参与了NKT细胞的发育。 NKT细胞识别自身抗原 ,具有 CD1限制性。NKT细胞通过调节 Th1和 Th2细胞发育参与免疫调节。NKT细胞的研究结果无论对免疫学基础理论还是多种免疫性疾病的临床治疗都有着重要的意义。     

猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞观察

本研究用HRP—SBA标记技术、甲苯胺染色法及甲苯胺蓝和HRP—SBA双重染色技术,观察了猪子宫大豆素(SBA)受体细胞和肥大细胞.发现SBA受体细胞和肥大细胞,形态相似,但两者在子宫壁内的分布和数量不同.双重染色证明,SBA受体细胞和肥大细胞是存在猪子宫内膜的不同细胞.     

大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究

本文旨在测定纯化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性。测定大豆凝集素对红细胞的凝集能力时,采用2%兔红细胞悬液,测定了使兔红细胞50%凝集的蛋白质浓度。测定对兔小肠上皮细胞的凝集能力时,采用荧光标记SBA与新鲜小肠上皮细胞结合后,观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定量。经血凝试验结果表明,使兔红细胞50%凝集的SBA蛋白质浓度为2.50~3.69μg/mL,而SBA对鸡的红细胞没有凝集作用。SBA对兔小肠上皮细胞有结合能力,结合率为30%左右。试验结果说明大豆凝集素的血凝活性具种属特异性,用SBA与小肠上皮细胞的结合率作为评价其抗营养活性的指标具一定可行性。     

猪圆环病毒2型PK15细胞系高敏感性细胞的克隆

利用有限稀释法从现有PK15细胞系中克隆出一株对猪圆环病毒2型具有高敏感性的细胞克隆株PKK,初步研究了该克隆株对猪圆环病毒2型增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光实验结果表明将该克隆株连续传代50代后对猪圆环病毒2型感染性不变,病毒滴度最高可达107.0TCID50/mL。这一研究结果将有利于进一步研究猪圆环病毒2型体外复制、体外诊断及开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗。     

干细胞工程--生命科学中的一个热点(续)

5．1．4 成体干细胞的含量很少，约占细胞总数1／10^-6，许多成体干细胞特异性标志还不清楚，从细胞形态和生长特征来分离干细胞不太容易。实验证明，利用单克隆免疫吸附能识别细胞类型或细胞谱系的表面抗原特性。可通过免疫磁珠筛选、流式细胞分离等方法将成体干细胞分离出来，而且其分离纯度和细胞活力都很高。     

Caspase非依赖性细胞死亡的研究进展

细胞凋亡是一种生理性细胞死亡机制，它是由多基因调控的一种细胞的主动的自杀性过程。一般认为它是由蛋白酶caspases通过两种途径激活的。但是，近年来研究发现除caspases引起的细胞凋亡外，还有caspases非依赖性的细胞死亡形式存在，包括细胞的自我吞噬作用、细胞蛋白酶体的降解和线粒体途径。这些途径无论是在试验的条件下还是在生理或病理的情况下都可以观察到。目前认为凋亡诱导因子(AIF)在caspases非依赖性的细胞死亡中起关键作用。