自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展

原始生殖细胞（PGCs）是哺乳动物各级生殖细胞的祖细胞。PGCs在体外合适的培养条件下，可自我更新，形成具有ES特征的多能干细胞系，称作胚胎生殖细胞（EG细胞）。EG细胞高度类似于ES细胞，PGCs可作为哺乳动物ES细胞分离克隆的一个有效替代途径，本研究对自PGCs分离克隆哺乳动物ES细胞的研究进展及其相关问题作一简述。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞研究

提取第28 期鸡胚性腺中的原始生殖细胞(PGCs)，将其与性腺基质细胞共培养，并对PGCs 进行PAS (过碘酸希夫试剂) 和AKP(碱性磷酸酶) 染色鉴定。构建pLenti-CMV-eGFP 慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT 细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19 %。实验还比较了慢病毒不同剂量对转染效率的影响，随着慢病毒剂量的增加，转染效率显著提高。     

慢病毒载体体外转染鸡胚原始生殖细胞

提取第28期伊萨鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGCs),将其与性腺基质细胞共培养,并对PGCs进行PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定。构建pL-CMV-eGFP慢病毒表达载体,与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs,转染率高达24.19%。     

影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素

探讨胚龄培养液、细胞因子、饲养层细胞等因素对人类胚胎生殖细胞分离克隆的影响。以4～13周龄流产胎儿生殖嵴或性腺为材料，小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、人胎儿成纤维细胞(hEF)、STO细胞和牛胎儿成纤维细胞(bEF)作饲养层，高糖DMEM(Dulbecco's minimum Eagle’s medium)为基础培养液，添加10^-4mol／L 2Me(2-巯基乙醇)、胎牛血清(FBS)或新生牛血清(NBS)、白血病抑制因子(LIF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞冈子(SCF)等为培养液，探讨影响人类胚胎生殖细胞分离克隆的因素。结果表明7～12周流产儿适于人类胚胎生殖细胞的分离克隆；人类胚胎生殖细胞体外培养以添加15％FBS为宜：添加4ng／mL LIF 4ng／mL bFGF 20ng／mL SCF能明显改善人类胚胎生殖细胞的分离克隆；MEF、STO、bEF和hEF可提高人原始生殖细胞(PGCs)的贴壁率，能促进PGCs源的人类胚胎干细胞(ES)的分离效率；以MEF作为饲养层效果较好。     

精原干细胞的研究进展

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）指位于曲精细管基膜上的一类原始精原细胞,近年来因其在生产转基因动物方面有广阔的应用前景,受到了极大的关注。在胚胎发育前期,一小部分细胞分化形成原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）,并迁移至生殖嵴,PGCs随后增殖分化形成生殖母细胞并迁移至睾丸基底膜,随着雄性动物出生,生殖母细胞迁移至细精管并转化成SSCs。本文概述了近年来SSCs的研究进展,主要包括SSCs的分离、鉴定、体外培养体系以及SSCs诱导精子。此外,本文重点阐述了SSCs的研究前景。     

鸡胚血液原始生殖细胞的分离纯化及鉴定

家禽的原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是形成精子和卵子的前体细胞,可在性成熟的家禽体内生成精子和卵子,因此家禽PGCs可应用于以PGCs为基础的现代保种技术、转基因技术以及家禽的发育生物学等研究领域,具有重要的科研与应用价值。本研究使用Nycodenz密度梯度离心法在孵化至13~15期的鸡(Gallus gallus)胚血液中分离纯化鸡胚的PGCs,经显微注射针分拣后,PGCs的纯度可达99%以上,细胞直径主要集中于13~15μm;将所分离纯化的PGCs分别通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、高碘酸希夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色及阶段特异性胚胎表面抗原-1(stagespecific embryonic antigens-1,SSEA-1)免疫化学染色进行鉴定,染色结果均出现PGCs所特有的反应;使用活细胞荧光染料PKH26对分离纯化的PGCs进行标记,成功标记的PGCs在荧光显微镜下可观测到红色荧光,将约200个标记后的PGCs,通过腹主动脉注入孵化至14~16期的受体鸡胚中,在孵化至第8天的鸡胚性腺冷冻切片中,可检测到供体PGCs的存在,这一结果表明,所分离纯化的PGCs可定植于受体鸡胚的性腺中。本研究为以PGCs为基础的种质资源保存研究以及转基因技术研究提供了基础资料。     

从原始生殖细胞分离昆明小鼠EG细胞及其传代培养

为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。     

模拟微重力对鹌鹑胚胎原始生殖细胞及内脏器官发育的影响

本实验利用回转器旋转模拟微重力的生物效应，以鹌鹑胚胎作为实验材料，研究了鹌鹑胚胎生殖腺内原始生殖细胞的数目及内脏器官的组织学变化。结果表明，回转器旋转可使早期胚胎血液和生殖腺内的原始生殖细胞数减少;生殖腺、心脏、肝脏的组织学结构发生不同程度的损伤，但对肺脏，肾脏没有太大影响。     

梅岭土鸡原始生殖细胞的生物学特性

作为精原细胞和卵原细胞的祖细胞,由于其全能性的特点可作为体外胚胎发育研究的良好模型,而禽类独特的生理和发育特点使得其原始生殖细胞(PGCs)在转基因研究中有着巨大价值。本研究通过对孵化5.5d的梅岭土鸡(Gallus domesticus)胚生殖腺中分离得到的PGCs,接种于24孔培养板在温度37℃、95%空气和5%CO2的培养箱中进行体外培养;借助组织化学及免疫组织化学染色对PAS(高碘酸希夫氏染色)、AKP(碱性磷酸酶染色)、SSEA-1(胚胎阶段特异性表面抗原-1)以及TERT(端粒酶反转录酶)进行了鉴定;采用荧光定量PCR技术对PGCs阶段特异性表达基因Cvh(鸡Vasa基因同系物)、Cdh(鸡死端同系物)、Dazl(类无精症缺失)和干细胞多能性相关基因PouⅤ(POU结构域Ⅴ类转录因子1)、Nanog(nanog同源异型盒)、Sox-2(性别决定区Y盒2)基因表达进行了分析;利用脂质体介导法,将绿色荧光蛋白(pEGFP-N3)基因导入鸡PGCs细胞,结果表明,PGCs集落有典型的鸟巢状结构,且PAS、AKP、SSEA-1以及TERT染色阳性;PGCs阶段特异性表达基因Cvh、Cdh、Dazl和干细胞多能性相关基因PouV、Nanog和Sox-2在鸡PGCs中均远远高于在鸡成纤维细胞(CEF)中的表达;转染24h后,绿色荧光蛋白均匀的充满细胞质和细胞核,转染效率最高为16%,研究结果为禽类PGCs分化过程中基因调控及基因标记、转基因动物克隆等技术提供了良好基础。     

禽类原始生殖细胞

本文系统介绍了禽类原始生殖细胞的起源，分化行为，形成特点，体外培养及在生物工程中的应用等，着重探讨了原始生殖细胞体外培养条件下分化的潜力。     

从原始生殖细胞分离克隆牛胚胎干细胞的研究

从５～１３周龄的牛胎儿生殖嵴及其周围组织采用与其儿成纤维细胞共培养的方式分离得到大量原始生殖细胞（ＰＧＣｓ）集落。这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎干（ＥＳ）细胞的诸多特征,如有连续传代的能力（有两个胎儿分别传至６代和８代）,细胞集落有典型鸟巢状结构。ＡＫＰ染色阳性,体外分化实验具有形成类胚体力能力。上述表明该细胞具有多能性,类似ＥＳ细胞。     

原始生殖细胞的人类ES细胞的分离克隆

本研究收集47例4-13周龄人流产胎儿分离PGCs，采用与其生殖嵴/腺或类似物胎儿成纤维细胞共培养的方式，获得了具小鼠ES细胞或EG细胞特征的人类ES细胞，该类细胞在体外可自发分化为类胚体，成纤维细胞样细胞，神经胶质细胞样细胞及心脏跳动样细胞团等，同样方法自4例大于17周龄胎儿未观察到人类ES细胞，研究表明，采用共培养法可以从4-13周龄流产儿的PGCs分离克隆到人类ES细胞，最适宜胎龄为7-10周龄。     

鸡胚原始生殖细胞体外分化的研究

本文从第19期（孵化68~72h）鸡（Gallus domesticus）生殖嵴分离到原始生殖细胞（PGC），通过PGC-体细胞共培养进行了原代和传代培养，并对PGC做了c-kit免疫组化鉴定。通过改变PGC的体外培养条件，诱导PGC分化成了神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞，并分别通过神经元特异性烯醇化酶（NSE）和角蛋白（keratin）免疫组化进行了分化细胞的鉴定，均呈阳性。结果表明培养的鸡胚PGC在体外可分化成神经样细胞、上皮样细胞和骨骼肌样细胞。     

鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定

采用Ficoll密度梯度离心法分离第19期(孵化68～72 h)艾维茵鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGC)，通过体细胞-PGC共培养进行了原代和传代培养，对PGC进行了碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)鉴定，并用细胞增殖核抗原(PCNA)免疫细胞化学检测了传代于鸡胚饲养层上PGC的增殖活性。培养的PGC经AKP和PAS鉴定均为阳性，AKP阳性为红棕色，PAS阳性为深红色，PCNA染色显示PGC集落为红棕色，表明PGC处于增殖状态。同时比较了不同体外培养条件(5%~20%胎牛血清(FCS), ITS培养液(M199+ 10 μg/mL 胰岛素+5 μg/mL转铁蛋白+3×10-8 mol/L亚硒酸钠), 条件培养液, 15%FCS+ITS, 15%FCS+40% 条件培养液)下PGC增殖情况。发现未经密度梯度离心的PGC生长较离心的PGC好，且5%FCS在原代培养中起较好的促增殖作用；而传代培养时在不同培养条件下，5%FCS组或ITS组形成的PGC集落的直径较大，而仅用单纯的条件培养液效果并不明显。结果表明除鸡胚饲养层可作为PGC增殖的支持体系外，在体细胞-PGC共培养方式下5%FCS或单独的ITS也可作为PGC体外增殖的一种培养体系。