出血性大肠杆菌O157: H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶ H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势.构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右.重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA.二免后攻击50LD50的EHEC O157∶ H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短.结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值.     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原表位乳酸菌对实验小鼠免疫功能的影响

为了探讨表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗原表位乳酸乳球菌对小鼠安全性及免疫功能,以口服的方式给实验小鼠免疫重组乳酸菌,观察小鼠的精神状态,采用ELISA试剂盒方法检测免疫指标。结果表明：重组乳酸菌对小鼠的精神状态及体重均无影响,能显著提高小鼠血清中IgG和粪便sIgA的含量。与对照组相比,免疫后1周、2周、5周的血清中IgG的含量差异显著(P<0.05),3周、4周差异极显著(P<0.01),表明能显著提高小鼠体液免疫水平;能显著提高外周血中T淋巴细胞增殖情况,与对照组相比,差异极显著(P<0.01),表明能显著提高小鼠细胞免疫水平。表达TGEV S蛋白抗原表位乳酸菌能显著提高小鼠体液免疫和细胞免疫水平,具有良好的免疫原性,且安全可靠。     

3种免疫植物多糖对法氏囊活疫苗的免疫效果的影响

将60只1日龄北京白鸡,饲养至14日龄,随机分组进行传染性法氏囊中等毒力疫苗的免疫,各组分别添加黄芪、岩藻和油菜3种植物提取的多糖成分,添加剂量为10 mg/只。26日龄进行二免,首免及二免都采用滴鼻点眼方式进行。二免后定期采血检测法氏囊中和抗体效价和外周血淋巴细胞体外转化率。结果表明:二免后2周,除了油菜多糖以外,其他2种多糖添加组的中和抗体滴度与对照组相比无显著差异;各组的淋巴细胞体外转化率显著高于对照组,表明3种植物多糖成分能促进淋巴细胞增殖,有待于进一步开发为传染性法氏囊病的免疫增强剂。     

不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒S蛋白和猪流行性腹泻病毒S蛋白免疫原性的影响

本研究旨在探究不同佐剂对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白和猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白免疫原性的影响。IPGT诱导重组表达菌株Rosetta(DE3)-pET28a-TGEV-S2/3和BL21(DE3)-pET28a-PEDV-S1/2/3,制备重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,将重组蛋白等量混匀分别与3种佐剂ISA 71VG、ISA 201VG和ISA 15AVG进行乳化制备免疫原免疫蛋鸡;Western blot检测蛋鸡血清抗体效价,免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体与病原的反应活性;监测鸡群平均日增重。结果显示,重组蛋白TGEV-S2、TGEV-S3、PEDV-S1、PEDV-S2和PEDV-S3的分子量依次为25 ku、28 ku、26 ku、24 ku和21 ku。Western blot分析显示,5种蛋白均具有良好的免疫原性;疫苗二次免疫后7天抗体效价达到高峰,ISA 201VG佐剂组、ISA 71VG佐剂和ISA 15AVG佐剂组组最高抗体效价依次为64000倍、32000倍和8000倍,对照组未检测到特异性抗体;ISA 71VG和ISA 201VG组对产蛋率下降相对较大,ISA15AVG 佐剂疫苗免疫组对产蛋率影响相对较小,免疫后7天后试验组产蛋率恢复正常。ISA 71VG佐剂组蛋鸡平均日增重显著降低,ISA 201VG和ISA 15AVG佐剂组蛋鸡平均日增重与对照组无显著差异;ISA 201VG佐剂组血清抗体与病毒反应活性良好,中和效价可达1:256。ISA 201VG佐剂配伍的疫苗免疫效果优于其他两种佐剂疫苗。     

猪腹泻大肠杆菌LTa(R210G)和LTb原核表达及其在小鼠的免疫反应

大肠杆菌不耐热性肠毒素(LT)具有免疫增强作用,是良好的免疫佐剂.为了更好的研究其免疫增强效果,本研究将LT的两个亚基LTa(R210G)和LTb克隆到pGST中,原核表达ETa(R210G)和LTb,经Western-blotting分析,表达蛋白具有免疫原性.对表达蛋白进行大量纯化后,以卵清蛋白为模式蛋白(OVA)为模式蛋白,免疫小鼠,ELISA结果表明,OVA+LTa(R210G)佐剂组小鼠的抗体滴度最高,OVA+LTb和OVA+LTa+LT组抗体滴度相似,高于OVA+氢氧化铝组,而OVA+氢氧化铝组高于无佐剂OVA组.因此,LTa(R210G)和LTb具有良好的免疫增强作用,是一种极有希望的免疫佐剂.     

脂多糖与β葡聚糖对迟钝爱德华氏菌亚单位疫苗的免疫促进效果研究

为了研究脂多糖与β葡聚糖的协同免疫促进效果,本论文重组表达了迟钝爱德华氏菌的一个高效亚单位疫苗候选蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,利用纯化的重组GAPDH（rGAPDH）蛋白单独或混合脂多糖和β葡聚糖免疫牙鲆,免疫后通过检测牙鲆抗体水平、免疫相关基因表达及免疫保护力三方面指标变化对脂多糖和酵母β葡聚糖的免疫促进效果进行研究。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结果显示,脂多糖和β葡聚糖与rGAPDH蛋白共免疫组牙鲆的抗体效价在免疫后第14和30天均显著高于单独免疫rGAPDH蛋白的牙鲆,在第30天时其效价为211.76;荧光定量PCR检测结果显示,相比PBS对照组,牙鲆在注射免疫后脾脏组织中IL-1β、IL-6、MHC-IIα、IgM、TCRα及C型溶菌酶6种免疫相关基因表达量均出现不同程度的上调,而其中脂多糖和β葡聚糖与rGAPDH蛋白共免疫组牙鲆在免疫后多个时间点其基因表达水平均显著高于单独免疫rGAPDH蛋白的牙鲆;免疫保护性实验结果同样显示,脂多糖和β葡聚糖与rGAPDH蛋白共免疫组牙鲆在攻毒后累计死亡率显著低于对照组和单独免疫rGAPDH蛋白组,直至第14天累计死亡率为30%,相对免疫保护率为68%。研究表明,脂多糖和β葡聚糖作为疫苗免疫刺激剂使用可显著增强牙鲆的免疫应答水平,提升亚单位疫苗的免疫效果。     

鸡传染性鼻炎二价油苗免疫鸡群抗体动态研究

应用阻断ELISA (B ELISA)、血凝抑制试验 (HI)和血清平板凝集试验 (SPA)方法 ,检测了鸡群用鸡传染性鼻炎A、C二价油乳剂灭活疫苗免疫后 0～ 390d的血清阻断ELISA、HI和平板凝集抗体消长情况 ,并绘制了相应抗体曲线。结果表明 ,鸡体按规定免疫程序免疫后 ,A型B ELISA抗体和HI抗体在测定期内一直保持比较高的水平 ,C型B ELISA抗体首免 5 0～ 180d、SPA抗体在首免后 5 0～ 60d达到高峰 ,此后抗体缓慢下降 ,但各种抗体至少可持续 390d以上。结果进一步显示了二价苗良好的免疫原性以及B ELISA和SPA较好的敏感性 ,为二价苗、各种诊断方法或其试剂盒产品的进一步应用提供了参考。     

传染性法氏囊病病毒VP2蛋白B细胞抗原表位免疫小鼠试验

为检测Ⅰ型IBDVVP2蛋白线性B细胞抗原表位肽PJ14和PJ5的免疫原性,将人工合成并纯化的PJ14和PJ5分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联;将与BSA偶联的PJ14和PJ5分别免疫BALB/c小鼠,然后以与OVA偶联的PJ14和PJ5作为间接酶联免疫吸附试验抗原,分别测定免疫鼠血清中抗相应多肽的抗体。结果显示,免疫小鼠产生了抗PJ14和PJ5的抗体,抗体持续期达21周。表明PJ14和PJ5具有免疫原性。     

坦布苏病毒囊膜蛋白诱导的小鼠免疫应答

为了研究坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的免疫原性,利用大肠杆菌表达系统高效表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并对其诱导小鼠免疫应答进行了研究。结果表明,E蛋白免疫BALB/c小鼠后,免疫组小鼠血清中抗体效价均可达1∶51 200以上;同时,E蛋白可显著诱导血清中细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的表达,免疫组小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均极显著高于对照组(P0.01),IFN-γ含量则显著高于对照组(P0.05);此外,与对照组相比,E蛋白还可极显著刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖,上述结果表明,E蛋白免疫后,小鼠机体可产生显著的体液免疫和细胞免疫反应。攻毒保护性试验结果显示,攻毒后,经荧光定量RT-PCR检测,E蛋白免疫组小鼠脑、肝脏、脾脏、卵巢、肾脏中坦布苏病毒载量均显著低于对照组,表明免疫E蛋白可有效抑制坦布苏病毒在小鼠各个组织中的增殖。结果表明,大肠杆菌表达的坦布苏病毒E蛋白可作为坦布苏病毒亚单位疫苗的候选抗原,为进一步预防和控制坦布苏病毒病奠定理论基础。     

鸡IL-2重组杆状病毒的构建及其病理组织学研究

以鸡白细胞介素2(IL-2)为免疫刺激因子,探讨鸡IL-2重组杆状病毒(BV-LMI-IL-2)对鸡脏器的影响,为IL-2促进疫苗免疫的研究提供理论依据。以IL-2为目的基因,以p LMI为杆状病毒转移载体,构建BV-LMI-IL-2。最终使用BV-LMI-IL-2与新城疫(NDV)抗原疫苗BV-LMI-F进行单独免疫和联合免疫,观察鸡腺胃、肝脏、心脏、十二指肠等器官病理变化情况。免疫和攻毒试验结果显示:BV-LMI-F与BV-LMI-IL-2联合免疫时,保护率提高了12.5%,说明BV-LMI-IL-2对疫苗起到了免疫增强作用,可以作为免疫增强剂使用。对攻毒后的对照组死亡鸡只和免疫组死亡的鸡只剖检,观察病变器官和病理组织切片结果显示,联合免疫组器官无明显病理变化,证明鸡IL-2重组杆状病毒提高了对鸡脏器器官的免疫保护作用。     

牛IL-6基因原核表达及其对口蹄疫病亚单位疫苗的佐剂效应研究

为了研究荷斯坦奶牛白介素6(IL-6)基因作为佐剂对VP1蛋白免疫效果的影响,分别克隆IL-6基因和VP1基因,连接到载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-6P-1/BoIL-6、pGEX-6P-1/VP1、pGEX- 6P-1/BoIL-6/VP1。重组质粒在大肠杆菌RS21中高效表达,动物试验检测IL-6作为分子佐剂对豚鼠免疫应答的影响。结果表明：构建的重组质粒在原核系统中正确表达,以包涵体形式存在。表达的融合蛋白三次免疫豚鼠后,检测发现IL-6/VP1组能够诱导产生高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应,与疫苗组及VP1+FCS组免疫效果相当。本实验证实IL-6作为分子佐剂能够提高VP1的免疫效果。     

蟾酥注射液对新城疫疫苗免疫效果的影响研究

为了探讨蟾酥注射液对新城疫疫苗免疫效果的影响。选取1日龄健康雏鸡240只,随机分成4组,每组60只,设试验组（低剂量组、中剂量组和高剂量组）和对照组,选择不同浓度的蟾酥注射液与新城疫疫苗联合使用作为试验组。分别在21、28、35、42、49和56日龄,通过β-微量法,检测血清中ND-HI抗体;通过MTT法,检测外周血T细胞吸光度值（OD值）;通过称量体重和免疫器官重量的方法,检测免疫器官指数。结果显示：蟾酥注射液各组与对照组比较,ND-HI抗体水平、外周血T细胞转化、胸腺指数、法氏囊指数和脾指数均有不同程度的提高。说明蟾酥注射液能够提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,从而增强新城疫疫苗的免疫效果。     

左旋咪唑对新城疫灭活疫苗抗体滴度的影响

为探讨免疫增强剂左旋咪唑对新城疫灭活疫苗抗体滴度的影响,将20只20日龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只。分别皮下注射新城疫灭活疫苗0.5ml／羽,同时注射A组雏鸡高(0.6mg)、B组中(0.3mg)、C组低(0.15mg)剂量的左旋咪唑,对照组D不加。免疫后0d、7d、14d、21d和28d,翅下静脉采血并检测新城疫抗体滴度。结果显示：免疫前四组抗体水平基本一致,无统计学意义;免疫后7d,14d,21d,高、中、低三组抗体水平基本一致,四组的抗体水平相差均在2个滴度以内,统计分析无明显差异;免疫后28d,B组抗体水平较高。统计分析显示,对照组与高中低三组均有显著差异,但无剂量差异;在高中低 三组中,以中剂量添加最佳,抗体效价高（7.2log2）,但中剂量组与高、低二组的差异不显著。这表明,左旋咪唑的添加提高新城疫抗体滴度,并且与免疫后时间长短有关系。从趋势看,随着时间的推移,添加组的抗体水平好于对照组。     

果寡糖添加水平对崂山奶山羊产奶量、乳成分及血清免疫指标的影响

为研究果寡糖对崂山奶山羊产奶量、乳成分及血清免疫指标的影响。试验选用体重为(48.24±3.45) kg,产奶量、产羔日期相近,泌乳初期的初产崂山奶山羊健康母羊16只,随机分成4组,每组4只。对照组饲喂羊场常规饲粮;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组,试验组饲粮在常规饲粮基础上分别添加果寡糖（有效含量）10 g/(d·头)、15 g/(d·头)和20 g/(d·头)。试验期共70天,其中预试期14天,正试期56天。结果表明：（1）在整个试验阶段,试验Ⅱ组产奶量显著高于其他各组(P＜0.05);（2）试验组奶山羊的乳脂率、乳蛋白、非脂乳固体及乳糖含量均有所改善,但差异不显著(P＞0.05);（3）试验Ⅱ组及Ⅲ组血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)的含量均有显著提高(P＜0.05)。在奶山羊日粮中添加果寡糖可提高产奶量及血清中免疫球蛋白含量,对乳品质作用不明显,添加量以15 g/(d·头)为宜。     

牛蛙源无乳链球菌全菌疫苗免疫效果研究

将分离鉴定的无乳链球菌用0.4%的甲醛灭活,加弗氏完全佐剂制成灭活全菌苗,对牛蛙进行注射免疫。通过测定受免牛蛙血清中凝集抗体效价,总蛋白、免疫球蛋白的测定及免疫保护率的测定,探讨疫苗的免疫应答状况。研究结果表明,无乳链球菌全菌疫苗能够提高牛蛙的血清抗体水平及总蛋白、免疫球蛋白含量。此外,无乳链球菌全菌苗对牛蛙抗人工感染也具有较好的免疫保护作用。因此,将无乳链球菌全菌苗用于牛蛙链球菌病的防治具有广阔的发展前景。     

载板蓝根多糖MPEG-PLA聚合物微球对小鼠免疫力的影响

为研究载板蓝根多糖微球的免疫增强作用。利用实验室制备的载板蓝根多糖MPEG-PLA聚合物微球免疫小鼠,并测定小鼠血液的常规指标,即白细胞和淋巴细胞总数以及总IgG水平和腹腔巨噬细胞吞噬能力等免疫指标。结果表明：在给药后第7天和第14天,载板蓝根多糖微球40、20、10 mg组和板蓝根多糖组小鼠的各项免疫指标均高于空白微球组和生理盐水组,并且载板蓝根多糖微球各组在第14天时的免疫效果与第7天时的免疫效果相比较差异不显著,其中,微球组中以载板蓝根多糖微球20 mg组的免疫效果为最好,在第7天和第14天时小鼠的白细胞和淋巴细胞总数分别为(0.96±0.46)和(11.03±0.35)以及(8.73±0.51)和(9.44±0.42),总IgG水平为(33.541±0.458)和(32.713±0.481),巨噬细胞吞噬指数和吞噬百分率则分别达到(56.00±2.16)和(1.61±0.04)。载板蓝根多糖微球具有一定的免疫增强作用,虽然微球的短期免疫效果均低于纯板蓝根多糖,但是可达到长效免疫。