刨花润楠SRAP-PCR体系建立与优化

以刨花润楠(Machilus pauhoi)1.5 a生小苗幼嫩叶片为试材,对影响刨花润楠SRAP-PCR扩增的模板DNA量、引物、dNTP和Mg2+体积摩尔浓度、Taq DNA聚合酶、退火温度6个主要因素进行优化.结果表明,SRAP-PCR的最佳反应体系为:25μL的SRAP-PCR反应体系中,2.5μL 10×PCR buffer、模板DNA量60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、引物0.3μmol/L和Taq DNA聚合酶1.25 U.对优化的反应体系和扩增程序的验证结果表明,优化的刨花润楠SRAP-PCR反应体系和扩增程序是稳定可行的.     

国槐SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

为建立国槐(Sophora japonica)最佳SRAP-PCR反应体系,采用正交试验设计L16(45)对影响PCR体系的5个因素(模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq聚合酶和d NTP用量)4个水平进行了优化,确定了国槐的最优SRAP-PCR反应体系:Taq聚合酶1.5 U,d NTPs 0.30 mmol/L,模板DNA 90 ng,Mg2+2.0 mmol/L,引物0.3μmol/L,dd H2O补至20μL。各因素对PCR反应的影响从大到小依次为:Taq聚合酶d NTPs模板DNAMg2+引物。基于最佳SRAP体系,采用4个品种对120对引物进行筛选,共获得12对多态性好的引物组合。随机抽取两对引物基于毛细管电泳技术对此体系进行稳定性检验,扩增条带清晰、稳定、多态性高。该体系的建立以及筛选的引物组合为为进一步利用SRAP技术对国槐的遗传多样性、品种鉴定等方面的研究奠定基础。     

南酸枣ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以南酸枣叶片基因组DNA为模板,采用单因子实验方法对影响ISSR反应体系的dNTP、Mg2+、引物浓度、模板DNA、Taq酶等5个因子进行优化,结果表明,在20 L ISSR反应体系中,各反应物的最适含量为：2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、0.25～0.5 mol/L引物、20 ng DNA和0.5 U Taq聚合酶。利用该优化体系扩增85条ISSR引物,有65条有扩增产物,38条具有多态性,并且利用842引物扩增不同南酸枣DNA模板,扩增的目的条带清晰、多态性好、稳定性强,可以用于后期的南酸枣种质资源鉴定及遗传多样性研究。     

普陀樟SRAP-PCR反应体系的建立

以舟山群岛的普陀樟（Cinnamomum japonicum var.chenii）新鲜叶片为实验材料,采用L16（45）正交试验设计,对影响普陀樟SRAP-PCR反应的Mg2+浓度、dNTPS、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素组合进行了筛选。结果表明：适于普陀樟的SRAP-PCR反应体系（20μL）为2.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTPs、1.5 U Taq DNA聚合酶、0.4μmol/L引物、10 ng模板DNA、2μL 10×PCR buffer,该体系位点清晰,扩增稳定;利用该反应体系从100对SRAP引物组合中筛选出多态性好的引物24对。     

杉木 SRAP-PCR 反应体系优化与建立

采用L16（45）正交实验设计,对杉木SRAP-PCR反应体系中Mg^2＋、 dNTPs、 Taq DNA聚合酶用量、引物浓度及模板DNA用量等5个因素进行了优化,并确立了适宜杉木的最佳SRAP-PCR反应体系。杉木的SRAP-PCR最佳反应体系为：反应体系总体积为25μL,含2.0 mmol／L Mg^2＋、0.3 mmol／L dNTPs 、0.3μmol／L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶、50 ng模板DNA及1×PCR buffer。各因素对杉木基因组DNA SRAP-PCR扩增结果的影响程度不同,其中dNTPs浓度影响最大, Mg^2＋浓度的影响最小。运用杉木单株基因组DNA对优化SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明所确立的杉木SRAP-PCR反应体系稳定可靠。     

适用于厚朴的SRAP反应体系的建立与优化

利用正交试验L16(45),结合单因素试验对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记反应体系的5个因素(Mg2+,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPsTaq酶模板DNAMg2+引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+1.8 mmol.L-1,模板DNA100 ng,dNTP 0.24 mmol.L-1,引物0.40μL。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。     

锥栗SRAP反应体系的建立与优化

为了建立锥栗SRAP-PCR反应体系,从而为今后的锥栗分子生物学研究提供理论参考,以锥栗叶片基因组DNA为材料,采用单因素试验和正交试验相结合的研究方法,对影响锥栗SRAP-PCR反应体系的模板用量、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度这5个主要因素进行了优化试验。试验确立的适合锥栗的SRAP-PCR反应体系为:20μL体系中,模板DNA用量为40 ng,Mg2+浓度为1.8 mmol/L,dNTP浓度为280μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为2.0 U,引物浓度为0.6μmol/L。     

红松SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立红松SSR-PCR最佳反应体系,以CTAB法提取的红松针叶DNA为模板,应用单因子试验及L16(45)正交试验系统分析了DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶浓度等对SSR-PCR扩增结果的影响,并对延伸时间、热循环参数进行了探讨,建立了稳定的、可重复的红松SSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数。结果表明,PCR的最佳反应体系为:10μL体系中,1×PCRbuffer1μL、DNA模板50～120ng,Mg2+3mmol/L,dNTP0.4mmol/L,引物0.5μmol/L,Taq酶0.75U。利用该体系筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物13对。在此反应体系下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高。     

金樱子SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以广西南宁产的金樱子叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化。结果表明:适用于金樱子SRAP-PCR的最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、3μmol/L引物、25ng DNA及10×PCR Buffer;各因素对PCR反应影响由大到小依次为:Mg2+、DNA、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶。用7份不同来源的金樱子材料对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定可靠。     

油桐ISSR-PCR最佳反应体系的建立

在油桐遗传多样性研究中,为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR扩增结果,综合采用单因子试验和正交设计两种方法对影响油桐ISSR-PCR反应结果的4个因素(Taq酶、Mg2 、dNTP、引物)进行优化试验.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响,找出最佳反应水平.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析获得影响因素最佳反应水平.通过综合比较分析,最终建立了油桐ISSR-PCR反应的最佳反应体系,即在20 μL反应体系中,Taq DNA聚合酶1.0 U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,1× PCR缓冲液,40 ng模板DNA.