大厂茶紫芽品系P113不同季节花青素调控相关基因表达分析

为明确大厂茶紫芽品系P113在不同季节花青素积累的分子机理及合成途径上相关基因的表达特点,对春、夏、秋3个季节的P113一芽二叶进行转录组（RNA-Seq）和代谢组（UHPLC-MS/MS）分析。结果显示,检测到的10种花青苷衍生物含量随季节变化,其中4种随春、夏、秋季节变化呈上调表达,与其叶色表现一致;结构基因PAL、C4H、CHS、F3'5'H表达模式基本一致,均在夏季上调表达,在秋季的表达量与夏季无显著差异;4CL酶基因获得的2个差异表达基因均在夏季上调表达;F3H、DFR、ANS表达模式相似,均在夏季上调表达,且各有1个基因在秋季呈现下调表达;2个F3'H基因中有1个在夏季下调表达,1个随季节变化上调表达;FLS的13个基因均在夏季上调表达,而在秋季呈现不同表达模式;修饰基因LAR在夏季和秋季均出现两种表达模式;ANR仅获得1个差异表达基因,随季节变化上调表达;3个UGT79B1基因中有1个在夏季下调表达,在秋季上调表达,另2个仅在夏季上调表达,在秋季的表达量与夏季无显著差异;获得的7个CCoAOMT差异表达基因均在夏季上调表达,其中2个在秋季下调表达;调控基因bHLH、MYB随季节变化上调表达,对花青素合成有正向调控作用。研究表明,大厂茶紫芽品系P113在不同季节结构基因、修饰基因和调控基因的表达具有一定的时间特性,导致了花青素积累差异。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树抗逆相关基因ERF的克隆与表达特性分析

对利用cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF,通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树ERF基因cDNA克隆,其开放阅读框编码212个氨基酸,包含一个保守的结构域AP2/ERF,与多种植物ERF蛋白具有高度同源性。qRT-PCR分析表明,茶树ERF基因受低温、乙烯、脱水、NaCl等上调表达,最大表达量分别是诱导前的121.1、22.6、2.6和2.2倍。在不同组织器官中,茶树ERF基因在转录水平上存在显著差异,成熟叶片中表达最高,其次是芽,而根和茎中表达量较低且相当,花和种子中表达极低。推测该基因在茶树响应非生物胁迫中发挥重要作用以及在组织中的表达受到严格控制。     

茶树CsCDF1基因克隆及表达分析

采用SMART-RACE技术克隆了茶树Dof（DNA binding with one finger）基因CsCDF1的全长cDNA序列,并利用在线生物信息学软件对其进行了分析。采用实时荧光定量PCR分析该Dof基因在茶树不同组织间的表达差异和昼夜表达规律,及其在氮饥饿处理2周后对不同浓度氮素诱导的响应。该cDNA序列全长1β606βbp,包含1个编码464个氨基酸的完整开放阅读框,含有高度保守的DOF结构域,推导的蛋白分子量为50.8βkDa,理论等电点（PI）为5.52;其编码的蛋白序列与茸毛烟草、马铃薯和美花烟草的CDF蛋白（Cycling dof factor）相似性分别为69%、67%、68%。系统发育分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥CDF蛋白聚为一类,因此将其命名为CsCDF1;CsCDF1在3个不同茶树品种根系中的表达量均高于一芽二叶和成熟叶;在一天中,该基因的表达呈现出昼夜节律变化;在氮饥饿后重新供氮,不同组织中该基因对不同浓度氮素的响应均为上调。     

茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的克隆及差异表达特征分析

利用NCBI茶树转录组数据库,以铁观音芽叶为材料,克隆了茶树细胞色素P450基因CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长。CYP71A26与CYP71B34的cDNA全长分别为1β879βbp和1β764βbp,分别含有1β539βbp（编码513个氨基酸）和1β533βbp（编码511个氨基酸）的完整开发阅读框。氨基酸序列比对结果显示,CYP71A26与CYP71B34的同源性为42.47%,为2个亚家族基因。氨基酸结构分析表明,2个基因均具有植物P450的螺旋C（Helix C）、螺线I（Helix I）、螺线K（Helix K）、“Meander”区域序列和血红素结合域（Heme binding domain）的典型结构。进化树分析显示,CYP71A26与CYP71B34在分子进化树上分属两大分支,2个基因与其他物种亲缘关系的远近不同。三级结构模拟与功能域分析显示,CYP71A26与CYP71B34主要由N端的β折叠和C端的α螺旋结构组成,且2个基因均具有一个P450蛋白结构域（Pfam domain）。荧光定量PCR结果表明,CYP71A26与CYP71B34基因在不同茶树害虫为害的叶片中,分别表现出上调和下调表达的现象。而在冷热环境下,CYP71A26与CYP71B34基因分别表现出下调和上调表达的现象。表明茶树CYP71A26与CYP71B34基因均参与了生物（害虫）与非生物（温度）的胁迫响应,但两个基因表达相反,参与环节可能相反。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

利用基因芯片筛选茶树芽叶紫化相关基因

采用基因芯片技术对龙井群体中紫芽资源和绿芽资源进行分析,探索茶树紫化相关的差异表达基因。结果检测到差异表达基因43个,其中上调表达基因17个,下调表达基因26个。以基因芯片中紫芽资源上调基因TC0002e03和下调基因TL016D09、TL011D06,及不变基因TL022H08、TL024B05为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用数据库查询方式对43个差异表达基因进行功能注释,结果表明差异表达基因主要与能量代谢、次生代谢和转录调控等分子功能有关,特别是在差异表达基因中还包含两个与花青素代谢途径直接相关的基因,苯丙氨酸解氨酶和花青素还原酶基因,同绿芽资源相比,它们在紫色资源中分别下调3.44倍和上调2.09倍;同时还筛选到两个可能调控花青素合成的转录因子MYB蛋白和WD40蛋白,分别上调2.25倍和2.54倍。这些研究结果将为深入理解茶树芽叶的紫化机理,克隆相关基因打下基础。     

茶树橙花叔醇合成酶CsNES基因两个可变剪接转录本的功能分析

茶树橙花叔醇合成酶CsNES是催化(E)-橙花叔醇生物合成的关键酶。基于茶树全长转录本及基因组数据分析显示,橙花叔醇合成酶基因CsNES除全长转录本外,还存在两个较短的可变剪接基因亚型。利用5′RACE方法验证了CsNES基因分别在第二、三个外显子上存在可变的转录起始位点,并命名为CsNES-2和CsNES-3。体外蛋白重组显示,CsNES-2和CsNES-3表达产物均能够催化底物法尼基焦磷酸FPP生成(E)-橙花叔醇。基因表达分析显示,CsNES-2和CsNES-3在花中的表达量较高,在叶片中的表达水平较弱,而在嫩叶中的表达水平显著高于成熟叶片。在激素GA和MeJA处理下,CsNES-2和CsNES-3能够被MeJA诱导并上调表达。结果表明,CsNES基因存在5′端可变剪接事件,且其可变剪接产物具有催化活性,这为后续研究基因可变剪接机制对茶树萜类代谢的调控有重要指导意义。     

外源24-表油菜素内酯对茶树光合特性的影响

以中茶108为试验材料,研究喷施不同浓度（0.10、0.30、0.50mg·L^-1）24-表油菜素内酯（EBR）对茶树叶片叶绿素含量、气孔开度、光合气体交换参数及其相关基因表达的影响。结果表明,处理后第一天,叶面喷施0.10、0.30mg·L^-1 EBR显著增加了茶树叶片叶绿素含量,与对照相比,分别增加了38.89%、22.22%。处理后第三天和第五天,0.10、0.30mg·L^-1 EBR处理的茶树叶片气孔开度显著升高。处理后第一天和第五天,喷施EBR显著提高了茶树叶片的净光合速率。同时,EBR处理能显著上调BR合成酶基因、碳同化关键酶基因、叶绿素合成关键酶基因的表达。综上,外源EBR通过调控相关基因表达调节茶树叶片叶绿素含量、气孔开度,进而提高茶树叶片的光合作用能力。     

特异茶树品种“紫娟”叶色转变的基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究了特异茶树品种"紫娟"幼嫩叶片和成熟叶片的基因表达差异。从256对引物组合中获得59个差异表达带,其中在幼嫩叶片中获得26个上调片段,成熟叶片中获得33个上调片段。通过GenBank BLASTX比对分析,所获得的片段包括转录因子、代谢相关蛋白、信号蛋白以及一些假设蛋白、未知蛋白和没有比对的基因片段。利用RT-PCR对片段ZM4、ZM7、ZM12进行表达特性分析表明,ZM4、ZM7、ZM12均在成熟叶片中上调表达。这些研究结果将为深入研究理解"紫娟"茶树叶色转变的机理,以及相关基因克隆打下基础。     

茶树新梢内源激素与叶片色泽形成的调控关系研究

以3个紫化茶树品种（系）（紫福星1号、紫娟、红叶1号）、2个绿叶品种（肉桂、福鼎大白茶）以及1个白化品系（白鸡冠）为供试材料,对主要呈色物质（花青素、叶绿素、类胡萝卜素）以及三类植物激素[脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）]的含量进行检测。结果表明,紫化茶树品种的花青素和ABA含量普遍较高,两者呈极显著正相关;ABA与叶绿素、类胡萝卜素则呈显著负相关。通过分析紫化茶树不同叶位的ABA与花青素含量,结合两者相关基因在不同叶色茶树叶片中的表达情况显示,ABA对茶树花青素合成起促进作用。     

基于转录组测序对茶树GST基因表达的研究

谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)在植物体内普遍存在,是一类具有多种生物学功能的超家族蛋白酶。本研究通过对中黄2号、龙井43在正常光照和遮荫处理下的转录组测序,筛选获得了49个Cs GSTs基因家族成员,并对其中19个在芽叶中表达量较高的Cs GSTs基因进行了序列分析和聚类分析。另外对表达量较高的8个候选基因进行荧光定量表达分析,研究它们在龙井43不同叶位中的表达模式。结果表明这些Cs GSTs基因在一芽一叶到第六叶中均有表达,但各自呈现出不同的变化规律。Cs GST20在龙井43一芽一叶到第六叶中的表达量逐渐上升,可能与植物抗胁迫有关,而Cs GST24的表达量则显著下降,可能与花青素代谢有关。     

红紫芽茶花青素合成关键酶活性与重要酚类物质相关性研究

以广东的红叶1号、红叶2号、丹妃和云南紫娟4种红紫芽品种（系）为供试材料,以英红九号绿芽品种为对照,通过分析酶活性研究了红紫芽茶花青素合成关键酶活性变化规律,并揭示了其与花青素、茶多酚、儿茶素组分等重要酚类物质含量的相互关系。结果表明,红紫芽茶花青素合成过程中,同一季节不同品种（系）类黄酮-3-O-糖基转移酶（UFGT）活性与茶多酚总量和花青素含量均显著正相关,为花青素合成的关键酶;而苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合成酶（CHS）、类黄酮-3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）、黄酮醇合成酶（FLS）、花青素合成酶（ANS）和花青素还原酶（ANR）等活性能力与花青素含量变化趋势不存在密切的相关性;春季各样品儿茶素（C）含量与PAL酶活性显著正相关,表儿茶素没食子酸酯（ECG）含量与DFR酶活性存在显著正相关;同一季节不同品种（系）CHS、F3H、ANS以及ANR酶活性与酚类物质含量无显著相关性。     

柱花草苯丙氨酸解氨酶（SgPALs）对生物胁迫与非生物胁迫的响应

本研究以热研2号柱花草为材料,分析其苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、总酚含量、类黄酮含量、总抗氧化能力和SgPALs基因表达模式对生物胁迫（炭疽菌侵染）与非生物胁迫（干旱和盐胁迫）的响应。结果表明,在3种胁迫处理下,柱花草不同组织部位的PAL活性增加18.58%~123.56%,且叶片的总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力分别增加65.11%~68.00%、51.00%~76.87%和83.00%~262.08%,差异显著。在干旱和盐胁迫处理下,根系的总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力也显著提高43.77%~51.12%、45.46%~45.98%和60.45%~97.89%。随后对SgPALs的表达模式分析表明,除SgPAL4外,其他3个SgPALs受炭疽菌侵染诱导上调表达;在干旱胁迫下,根系中4个SgPALs均增强表达,但叶片中仅SgPAL1和SgPAL4上调表达;在盐胁迫下,根系中4个SgPALs也都上调表达,叶片中除SgPAL3下调表达外,其他3个SgPALs增强表达。综上所述,在遭受生物胁迫和非生物胁迫时,柱花草中的SgPALs基因表达及PAL酶活性升高,伴随着总酚与类黄酮含量的同步升高,表明其对环境胁迫的抗性升高。     

大豆异黄酮合成关键酶基因对蚜虫取食的防御响应分析

以蚜虫差异抗性的大豆品种PI567598B(高抗)、绥农30(抗)、东农51(中抗)和Williams 82(感)为试验材料,分别于接种大豆蚜虫0,7,14和21 d时采集大豆叶片,利用q PCR对异黄酮合成关键酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄烷酮-3-3羟化酶(F3H)、大豆异黄酮合成基因1(ISF1)和大豆异黄酮合成基因2(ISF2)的表达量进行分析。结果表明:蚜虫取食前高抗品种PI567598B中PAL、F3H、ISF1和ISF2基因的相对表达量均高于感虫品种Williams 82;蚜虫取食后,抗蚜品种PI567598B和绥农30中PAL基因在蚜虫取食14 d时显著上调,在21 d时达到最大,F3H基因7 d时表达量最高,然后降低;IFS2表达量于蚜虫取食7 d后显著上调,在21 d时达到最大;中抗品种东农51中PAL、IFS2和F3H基因表达量在7 d时增加,但不显著;而感蚜品种Williams 82蚜虫取食后PAL和IFS2表达量增加但不显著,且相对表达量显著低于抗蚜品种,F3H基因表达量不增反降;抗感大豆品种蚜虫取食后IFS1基因表达均诱导不显著。研究表明,感蚜大豆品种蚜虫取食前后异黄酮合成关键酶基因表达量都比较低,而抗虫品种异黄酮合成关键酶基因表达量高,且防御响应持续时间长,符合其抗性差异。     

木薯苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其对低温胁迫的响应

本研究从全基因组水平对木薯（Manihot esculenta Crantz）苯丙氨酸解氨酶编码基因（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）进行鉴定,并以木薯品种KU50为材料克隆了6个PAL基因,分析了低温胁迫（7 ℃）对叶片MePAL表达模式、PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的影响。结果表明：低温处理使木薯叶片迅速萎蔫卷曲,并伴随叶片PAL酶活性、总酚含量、类黄酮含量和总抗氧化能力的显著提高。Real-time PCR分析表明,在低温处理前,MePAL1和MePAL2的相对表达量分别为0.83和1.19,显著高于其他4个MePAL基因,低温处理后6个MePAL基因均不同程度受低温胁迫诱导增强表达,其中MePAL5上调最高,达50.5~142.5倍。本研究结果初步显示低温胁迫上调了木薯叶片MePAL的表达,促进了总酚和类黄酮的合成,提高了抗氧化损伤的能力。     

基于LC-MS的紫娟烘青绿茶加工过程中花青素变化规律研究

优化建立了紫娟烘青绿茶中花青素的酸性乙醇提取方法和14种花青素组分的高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)分析方法,并进一步对烘青绿茶加工过程中花青素组分的变化进行了定量分析。结果显示:在紫娟烘青绿茶中,共检测到9种花青素成分:飞燕草-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷、天竺葵-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素、天竺葵素、飞燕草素、芍药素、飞燕草-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷,其中飞燕草类花青素和矢车菊类花青素为紫娟花青素的主要成分。紫娟鲜叶中花青素总量为4.64 mg·g~(-1),经摊放、杀青、揉捻、毛火干燥、足火干燥处理的茶样中花青素总量呈下降趋势,含量分别为4.83、3.74、3.70、2.83、1.82 mg·g~(-1)。高温处理是导致花青素下降的最主要因素,其中矢车菊素-3-O-半乳糖苷、飞燕草-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-(6-香豆酰)-半乳糖苷的下降最为明显。     

芒果MiFRI1和MiFRI2基因的克隆与表达分析

FRIGIDA(FRI)是植物春化途径中影响成花的关键基因之一.本研究克隆了2个芒果FRI基因,分别命名为MiFRI1和MiFRI2.序列生物信息学分析结果显示,MiFRI1和MiFRI2基因的ORF长度分别为1752、1815 bp,编码584、605个氨基酸,蛋白质分子量为64.98、66.86 kDa.进化树分析...