巨菌草根内生固氮菌Klebsiella variicola的分离、鉴定及培养条件的优化

采用Ashby和Nfb无氮培养基从巨菌草成熟期根部分离得到1株具有高效固氮性能的内生固氮菌GN02,其在分离的菌落中所占比例最高,且酶活性较高.经16S rDNA序列鉴定,该菌株与克雷伯氏菌属各菌株同源性关系可达99%,结合其形态、生理生化特征,初步鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola).在含氮源的KP培养基中菌株GN02的生长情况明显优于无氮源的Ashby培养基.菌株GN02在KP培养基中的最优培养条件为:温度37.1℃,pH 5.6,蔗糖25.6 g·L~(-1),在此条件下其D_(600 nm)能达到1.48,比优化前提高了22.31%.响应面优化所得到的培养条件重复性好,准确、可靠.     

巨菌草一株内生固氮菌的分子鉴定及生物学特性

菌草(JUNCAO)是可作为栽培食用菌、药用菌的草本植物。内生固氮菌具有生物固氮的功能,可以促进植物生长,提高植物对病原菌的拮抗作用。采用无氮培养基、乙炔还原法等方法从巨菌草根中分离纯化到1株具有较强固氮酶活性的菌株,固氮酶活性值为270.20 nmolC2H4/(mL·h)。通过16S rDNA序列分析,进一步确定该菌株属于变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。内生固氮菌株fjg102对稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分别为40.25%和44.30%,具有一定的抑制病原菌的作用。菌株fjg102革兰氏染色阳性,具有溶磷作用、触酶反应为阳性、明胶液化为阳性等生理生化特性。盆栽试验结果表明,接种fjg102菌株后对大麦有明显的促生作用。其中叶长增加37.26%,根长增长9.40%,根重增加66.16%,鲜重增加96.40%,干重增加80%。可见,该内生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果,可进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。     

巨菌草内生固氮菌与解磷菌互作效应及其混合菌肥制备

拟研究巨菌草内生固氮菌变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)与解磷菌胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)的相互作用,将以上2种菌分别纯培养和混合培养,测定其菌体数量、全氮含量和溶磷量,制备变栖克雷伯氏菌单菌株固氮菌肥和多菌株固氮菌肥,并研究2种菌肥对玉米盆栽的促生作用。结果表明,与纯培养相比,2种菌混合培养时全氮量和固氮菌数均有不同程度的增长,而溶磷量和解磷菌数较纯培养时有所下降;当按1∶1比例接种时,混合培养的协同作用最好;所制备的2种菌的混合菌肥符合国家行业相关标准,其有效活菌数、有效期和对玉米盆栽的促生性能均优于单菌株固氮菌肥。因此,多菌株复合菌肥具有更好的应用前景。     

一株巨菌草内生细菌的鉴定及其促生特性初步分析

以巨菌草为材料,采用组织块分离法、划线分离法筛选内生细菌,采用Salkowski比色法筛选具有分泌植物生长素(IAA)能力的菌株,同时采用钼锑抗比色法测定其溶磷能力、Ashby培养基验证其固氮潜能、CAS方法检测其产生铁载体能力,通过生理生化鉴定和16S rDNA分子生物学鉴定相结合的方法鉴定优良菌株的分类地位。结果表明:从巨菌草中筛选出86株内生细菌,其中菌株YA-6的产IAA能力最高(11.73 mg/L),且具有溶磷、固氮和产铁载体的能力,溶磷量为7.103 mg/L。菌株YA-6菌体杆状,呈革兰氏阴性,结合16S rDNA基因序列相似性分析鉴定属假单胞菌属,与Pseudomonas hunanensis同源性最高(99.36%)。巨菌草内生菌YA-6具有多种促生特性,具有开发为微生物农药的潜力。     

巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的克隆及生物信息学分析

研究巨菌草(Pennisetum giganteum)内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的生物学信息,对GN02菌株nifH基因进行克隆及完整性验证,并采用多种生物学在线软件对其进行生物信息学预测和分析。结果表明,GN02菌株nifH基因具有完整的ORF,长度882 bp,编码293个氨基酸,NCBI GenBank登录号为MK131264。生物信息学分析表明,GN02菌株nifH基因具有高度保守性,与其他物种来源的nifH基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均达到95%以上。nifH蛋白总相对分子量为31 970.73、理论等电点pI为4.72;跨膜模型倾向N-末端向外的由内到外的跨膜、整个多肽链表现为亲水性;有2个糖基化位点但无分泌信号肽,有可能存在螺旋卷曲结构;二级结构预测表明α-螺旋和无规则卷曲是其多肽链中的主要结构元件,延伸链散布于整个蛋白质中;在数据库中能对该蛋白进行三维同源建模。     

氮对巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因表达的影响

采用DNA电泳、qRT-PCR及Western blot技术分析了在无氮和含氮培养条件下,巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02菌株nifH基因序列长度、基因与蛋白表达量的差异.结果表明,GN02菌株在无氮及含氮条件下均有nifH基因表达,其克隆得到的nifH基因与同属禾本科的甘蔗的nifH基因亲缘关系较近;无氮培养条件下nifH基因和蛋白表达量明显高于含氮条件下的表达量.表明无氮条件能诱导GN02菌株nifH基因表达量的增加,而氮源抑制nifH基因的表达.     

玉米内生联合固氮菌的分离与鉴定

试验对玉米内生固氮菌进行分离、鉴定,并研究内生细菌与玉米的联合固氮活性。结果表明,从玉米中分离出5株具有联合固氮活性的菌株,分别为1株弯曲假单胞菌NFR19(Pseudomonas geniculata),2株产酸克雷伯氏菌NFL28与NFSt18(Klebsiella oxytoca),1株节杆菌NFR7(Arthrobacter sp.),1株纤维化纤维菌NFR10(Cellulosimicrobium cellulans)。研究首次分离出具有固氮活性的纤维化纤维菌,并证实节杆菌具有固氮活性。从环境中筛选新的玉米内生固氮菌资源,促进玉米生长,为玉米内生联合固氮细菌的应用奠定基础。     

玉米联合固氮菌的固氮活性及联合固氮效果

盆栽实验表明,分属于固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、克雷伯氏属(Klebsiella)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的9株玉米联合固氮菌均能在玉米苗根际繁殖并有固氮作用,且能提高植株的含氮量和干重。但不同菌株的固氮活性和玉米的联合固氮效果不同。     

新造地马铃薯根际固氮解磷微生物的分离与鉴定

【目的】揭示马铃薯根际土壤固氮解磷菌类群,分析其固氮酶活性和溶磷能力,为利用新造地作物根际促生菌提供依据。【方法】以采自延安市安塞区新造地的马铃薯根际土壤为供试样品,采用Ashby培养基和无机磷培养基分离纯化马铃薯根际固氮解磷菌,以16S rDNA基因分析马铃薯根际微生物类群组成,以乙炔还原方法测定其固氮酶活性,以溶菌圈法和钼蓝比色法测定其溶磷能力。【结果】从延安新造地马铃薯根际土壤中分离并筛选到9株固氮解磷菌,经鉴定分别属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、红球菌属(Rhodococcus)、节杆菌属(Paenarthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、肠杆菌属(Kosakonia)和副球菌属(Paracoccus)等8个属;9株固氮解磷菌均具有固氮和溶磷特性,其固氮酶活性在11.88～95.08 nmol/h,其中菌株N34的固氮酶活性最高,且与其他菌株的固氮酶活性差异显著;9株固氮解磷菌株溶磷能力存在一定的差异,溶磷能力为22.05～54.9 mg/L,其中菌株N46的溶磷能力最好,7 d累积溶磷能力达到54.9 mg/L。【结论】分离纯化得到的9株固氮解磷菌均具有一定的固氮解磷能力,可用于开发马铃薯功能菌肥。     

白蚁及其肠道细菌的固氮作用研究

台湾家白蚁(Coptotermes formosanus Shiraki)工蚁具有较高的固氮活性,刚收集的工蚁其固氮活性达0.094 4 μg/g*h-1.固氮活性的高低受白蚁食物含氮量、白蚁生理状态的影响,某些杀菌剂能使白蚁固氮活性丧失.从台湾家白蚁肠道中分离到2株兼性厌氧固氮菌HN1和YN菌株,经鉴定皆为柠檬酸菌属的菌株(Citrobacter sp.),均在厌氧条件下表现固氮活性.最大或然数法计数表明,每只白蚁肠道固氮菌数量约为7 500个.     

巨菌草促生菌的筛选及其促生效应

以陕西和新疆两地采集的巨菌草为材料,从中筛选分离得到内生菌株103株,采用解磷、固氮和产IAA等筛选标准,对初筛菌株进行促生能力的测定,其中4株菌株同时具有多种促生作用;通过形态观察、生理生化和16Sr DNA序列分析,对这4株促生菌株进行分类鉴定,结果显示菌株XJ–4和SX–12均归属于肠杆菌属(Enterobacter),SX–30归属于芽孢杆菌属(Bacillus),XJ–12归属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。采用单菌接种和多菌混合接种小麦盆栽试验,测定促生菌的促生效应,结果表明,与对照组相比,多菌混合接种对小麦的促生效应优于单独接种处理的,经SX–30、SX–12和XJ–4混合菌液处理,小麦叶绿素含量增加了129.94%;经SX–12和XJ–4混合菌液处理,小麦幼苗鲜重增加了182.12%。     

不同农作物根际自生固氮菌分离及固氮酶活性

为了解高海拔地区农作物根际土壤自生固氮菌分布及优势菌株情况,以未施肥的油菜、玉米、青稞、小麦4种农作物种植点为采样地,对作物根际土壤自生固氮菌进行分离提纯,并根据其固氮酶活性筛选固氮能力较强的菌株。结果表明:油菜根际自生固氮菌数量较多,其固氮能力较其他3种作物更高,其中固氮性最好的菌株为德克斯氏菌属(Derxia spp.)菌株。     

辣椒叶际固氮菌分离筛选及抑菌活性

为后续研制叶面微生物菌肥提供优良固氮菌种，以辣椒为研究对象，利用选择性培养基分离、筛选辣椒叶际固氮细菌，测定其固氮能力和植物病原菌的拮抗能力并对性能优良的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定。研究表明，从辣椒叶际共分离得到2株具有高效固氮性能的自生固氮菌LJ-1和LJ-2,分别鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.)和根瘤菌(Rhizobium sp.),固氮酶活性分别达93.26和102.23 U·L^-1。两株菌具有广谱抗真菌活性和耐酸碱能力，对油菜菌核病菌、番茄灰霉病菌和棉花立枯病菌抑制效果可达50%以上。因此，辣椒叶际固氮菌LJ-1和LJ-2是具有固氮和生防作用的多功能细菌，可为进一步研发优良的叶际固氮菌肥提供微生物资源。     

小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌及其系统发育

【目的】了解小麦、水稻、玉米、白菜、芹菜内生固氮菌的主要类群,确定内生固氮菌的系统发育地位。【方法】样品表面灭菌后采用无氮培养基分离、培养内生固氮菌,乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;PCR扩增得到菌株16S rDNA,通过序列测定和相似性分析研究菌株的系统发育。【结果】从大田小麦体内分离到内生固氮菌34株,固氮酶活性在0.30-30.24 nmol C2H4/h•mg蛋白,基于16S rDNA序列最大相似性,这些菌株分属于假单胞菌（Pseudomonas）、根瘤菌（Rhizobium）、芽孢杆菌（Bacillus）、黄杆菌（Flavobacterium）等13属21种,种群分布较为广泛;从大田水稻体内分离到内生固氮菌25株,固氮酶活性在3.12-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于芽孢杆菌、伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）、肠杆菌（Enterobacter）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等9属16种,伯克霍尔德氏菌、肠杆菌和克雷伯氏菌是水稻内生固氮菌特有种群;从大田玉米体内分离到内生固氮菌9株,固氮酶活性在7.27-59.58 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等5属6种;从盆栽试验小白菜体内分离到内生固氮菌14株,固氮酶活性在2.33-205.21 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于根瘤菌、节杆菌（Arthrobacter）等6属8种;从市售芹菜体内分离到内生固氮菌10株,固氮酶活性在1.23-46.70 nmol C2H4/h•mg蛋白,属于鞘氨醇单胞菌、假单胞菌等5属8种。【结论】在生长期小麦、水稻、玉米和部分蔬菜体内普遍存在内生固氮菌,菌株固氮酶活性差异较大,在0.30-254.12 nmol C2H4/h•mg蛋白,系统发育地位分属于假单胞菌、根瘤菌、芽孢杆菌等25个属的56个种,这些内生固氮菌对于农业生产有巨大潜能。     

水稻根系内生固氮菌的分离鉴定及其促生作用研究

【目的】研究不同生育期水稻根系内生固氮菌的多样性,分离鉴定内生固氮菌并筛选具有促生作用的菌株,为水稻生产中固氮菌的应用提供理论依据。【方法】采用无氮培养基培养方法,从拔节期和抽穗期佳辐占根系中分离内生固氮菌,通过扩增16S rRNA方法进行分子鉴定和系统进化分析;采用透明圈法进行溶磷解钾能力验证;采用乙炔还原法测定固氮酶活性。将分离的内生固氮菌株单独接种盆栽水稻幼苗,测定其对株高、根长、鲜质量的影响;将内生固氮菌混合菌液接种水稻品种佳辐占和台粳8号,于齐穂期测定倒1、倒2和倒3叶片的叶绿素含量（SPAD值）。【结果】从拔节期和抽穗期水稻根系中分别分离出10和20株内生固氮菌,且两个时期水稻根系内生固氮菌群多样性存在差异,拔节期以克雷伯氏菌属为主,而抽穗期以假单胞菌属为主。筛选出7株具有溶解无机磷能力的菌株,分别是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37。乙炔还原法测定结果表明,分离的内生固氮菌均具有弱固氮活性,其中 H33和H40-2菌株固氮能力相对较强。将固氮菌回接水稻幼苗,H40-2和J3菌株对水稻株高、地上鲜质量、根长均有显著影响,可促进水稻生长。将固氮菌混合回接水稻根系,发现佳辐占叶片叶绿素含量与对照差异不显著,而台粳8号显著提高。【结论】分离的内生固氮菌株H40 2和J3在水稻苗期具有明显促生作用,可作为功能性内生固氮菌开发利用。     

玉米秸杆降解菌筛选鉴定及其盆栽试验对生土性能影响

从山西地区林地土壤中筛选得到纤维素降解菌X-7,固氮菌N-8,经16S r DNA序列比对,X-7和N-8分别属于坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)和肠杆菌属(Enterobacter)。菌株X-7在50℃时活性最高,对玉米秸秆降解率为62.9%,滤纸酶活力和CMC降解酶活力最大分别为90.78和168.54 IU·m L-1。发酵液p H与纤维素酶活性有一定相关性,纤维素酶高活性主要集中在发酵液p H 8.8~9.0。固氮菌N-8固氮能力为45 mg·L-1。为评估两株菌在山西干旱气候下对生土种植性能影响,作盆栽紫花苜蓿试验。结果表明,生土中添加玉米秸秆和纤维素降解菌X-7及固氮菌N-8显著提高生土抗旱能力及苜蓿平均株重和株高。菌株X-7在生土中可有效定殖并提高生土中纤维素降解菌数量1~2个数量级,可为山西地区黄土母质生土改良沃化提供参考。     

一株拮抗病原真菌的固氮菌Paenibacillus spGD812

 【目的】筛选具有拮抗病原真菌功能的固氮菌,研究菌株的固氮酶活性、nifH、生理生化特征、菌株抗逆性与接种效果等,并对该菌株进行鉴定,为微生物肥料生产筛选菌种资源。【方法】采用无氮培养基富集、筛选固氮菌,用对峙法筛选拮抗菌;乙炔还原法测定固氮酶活性,PCR扩增16S rDNA和nifH;通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种;采用温室盆栽小白菜试验接种效果。【结果】筛选到1株固氮菌GD812,该菌株固氮酶活性达到30.661 nmol C2H4/h•mg蛋白,同时具有拮抗麦类赤霉病菌（Gibberella zeae）和棉花黄萎病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）功能,抑菌率分别达到59.5%和49.3%;根据形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果,GD812被鉴定为类芽孢杆菌Paenibacillus sp.;该菌株的nifH基因长度300 bp,与Paenibacillus sp. Bs57 nifH基因序列相似性98%;GD812可以利用35种供试碳源中的20种,耐酸碱pH4—11,在4—50℃均可生长,盆栽试验接种比对照小白菜鲜重增加52%。【结论】固氮菌GD812被鉴定为类芽孢杆菌,该菌株利用碳源广泛,抗逆性强,具有较高的固氮酶活性和拮抗病原真菌能力,盆栽试验显示较好的接种效果,可望进一步研发成为优良的固氮微生物肥料生产菌种。     

复合微生物肥料功能菌的筛选及其对黄瓜幼苗的促生作用

为了筛选出分别具有固氮、解有机磷、解有机氯功能的菌株,并利用它们其生产复合微生物肥料,从供试土壤中分离出目的菌株,测定其代谢能力,对其进行生理生化和分子鉴定,并评价其对黄瓜幼苗的促生作用。结果表明,分离得到代谢能力较强的固氮、解有机磷、解有机氯菌株GN6、JP2、JC1,经生理生化和分子鉴定确定GN6属于假单胞菌属(Pseudomonassp),JP2、JC1为芽孢杆菌属(Bacillussp),3株菌可以同时拮抗2种病原菌,且相互之间不发生拮抗。用GN6、JP2、JC1菌液分别接种处理黄瓜幼苗,其株高和地上部干质量与对照组相比有显著差异,3株菌株混合液处理对黄瓜幼苗的促生长作用与对照组和单独处理组相比均有显著差异。筛选出的菌株可以作为复合微生物肥料的功能菌株。     

比较基因组分析斯氏假单胞菌遗传多样性及固氮基因岛进化机制

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.37%;基于平均核苷酸相似度分析,这16个菌株被划分为11种不同的基因组变异型,表明斯氏假单胞菌基因组异质化程度高。固氮基因岛及进化树分析表明,5株固氮菌属于3种不同基因组变异型,它们的固氮基因岛及其侧翼序列保守性好,而且固氮酶基因进化树与菌株谱系进化树呈现高度一致性。据此推测,斯氏假单胞菌祖先可能通过水平基因转移的方式获得固氮基因岛,从而转变为固氮菌,但是在后期进化过程中,绝大部分固氮菌株丢失了固氮基因岛。     

新型固氮菌菌剂在蔬菜上的应用

固氮菌原始菌株来自水稻根系,属肠杆菌科.通过基因工程把含nifA质粒(pMC71A和pMC73A)引入到催娩克氏菌(Klebsiella oxytoca NG13)中,即可得到这种新型菌株.与普通的自生固氮菌相比该菌具有较强的固氮及促进植物生长能力,在水稻、甘蔗等作物上,已获得了较好的应用效果.目前的研究思路是着重在蔬菜应用,以减少化肥施用量,促进生长和提高蔬菜的产量.