利迪链霉菌A01活性代谢产物对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理

 【目的】明确生防利迪链霉菌A01菌株的活性代谢产物纳他霉素对甘蓝枯萎病菌的抑制作用及其机理,为其下一步的产品开发和应用提供科学依据。【方法】分别采用带毒平皿法和凹玻片法测定活性产物对病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,采用电导率法和美蓝染色法分别测定其对菌丝体细胞膜通透性和细胞存活性的影响,借助电镜观察其对菌丝超微形态和结构的影响。【结果】纳他霉素对甘蓝枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的最低抑菌浓度分别小于或等于31.92和41.04 μg•mL-1,抑制中浓度分别为8.69和3.06 μg•mL-1;30 μg•mL-1以上浓度的纳他霉素处理90 min后可使菌丝悬浮液电导率明显升高,其作用强度与纳他霉素的浓度和作用时间呈正相关;处理后的菌丝生长异常或畸形,并出现细胞器解体、细胞液泡化等现象;10 μg•mL-1以上纳他霉素处理120 min后菌丝大部分可被美蓝染成蓝色。【结论】纳他霉素对甘蓝枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发均有明显的抑制作用,能够增加病菌细胞膜的通透性,破坏菌丝细胞的形态和结构,导致其丧失存活能力。     

牛源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测

【目的】了解内蒙古地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】采用K-B纸片扩散法,检测分离自内蒙古地区38株金黄色葡萄球菌对17种药物的敏感性,同时用琼脂稀释法检测苯唑西林、万古霉素对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）;再用头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法、苯唑西林盐琼脂筛选法和PCR方法扩增mecA耐药基因对分离菌株进行全面MRSA检测。【结果】分离菌株对每种抗生素都有不同程度抗性,对氨苄西林、头孢拉丁、青霉素、复方新诺明、新生霉素和链霉素的耐药率都高于45%,而对氧氟沙星、丁胺卡那霉素、万古霉素、环丙沙星、庆大霉素和头孢唑林的敏感性高于90%,2株细菌的万古霉素MIC≥16 μg•mL-1;其中8株细菌的苯唑西林MIC≥8 μg•mL-1,而其它菌株的苯唑西林MIC≤2 μg•mL-1;分离菌株多重耐药情况严重,耐受3种及3种以上药物的菌株占84.21%,其中4株细菌能同时耐受9种不同抗菌药物;16（42.11%）株细菌被检测携带mecA耐药基因,而仅有其中7株的苯唑西林MIC≥4 μg•mL-1;头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法和苯唑西林盐琼脂筛选法分别检出7株、10株和7株表型为MRSA的菌株。【结论】分离菌株的耐药性和多重耐药现象较为严重,被调查地区奶牛场中已经存在MRSA和OS-MRSA感染情况,且感染率高。     

五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型的建立和TLR2介导炎症相关因子的表达

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10 μg•mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表达量。【结果】分离得到的主动脉内皮细胞呈铺路石样整齐排列,且生长状态良好;细胞膜上表达CD31分子和Ac-LDL的受体,证实分离得到的细胞是血管内皮细胞。LPS刺激后细胞TLR2 mRNA水平的表达量明显升高（P＜0.05）,而TLR4 mRNA水平表达量无明显变化。添加LTA孵育后,细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的mRNA水平表达量较对照明显升高（P＜0.05）。【结论】成功建立了五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型,并检测到TLR2在LPS刺激内皮细胞后表达量升高,能够介导细胞炎症相关因子的表达。     

条斑紫菜R-藻红蛋白酶解物的制备及其抗氧化和肿瘤细胞增殖抑制活性

【目的】研究木瓜蛋白酶对条斑紫菜R-藻红蛋白的抗氧化性和肿瘤增殖抑制活性的影响。【方法】采用超声波破壁法提取条斑紫菜R-藻红蛋白,用DEAE柱层析法纯化后进行木瓜蛋白酶酶解,通过正交试验设计,以还原力A700为考察指标确定酶解反应的最佳工艺参数,进一步测定获得的R-藻红蛋白及其酶解物的还原力、清除羟自由基能力和对人肉瘤细胞U2O及人肝癌细胞HepG-2的肿瘤增殖抑制活性。【结果】R-藻红蛋白的最佳酶解工艺条件为：木瓜蛋白酶添加量25 000 U•g-1,pH 7.0,温度50℃,酶解时间4 h。在此条件下,R-藻红蛋白酶解物还原力为0.573,较未酶解的R-藻红蛋白提高了2.35倍;清除羟自由基能力为51.03%,较未酶解的R-藻红蛋白活性提高了3.22倍。随着浓度的增加,R-藻红蛋白及其酶解物对人肉瘤细胞U2O和人肝癌细胞HepG-2抑制生长作用增强。R-藻红蛋白对人肉瘤细胞U2O抑制作用的IC50值为2 431.32 μg•mL-1,其酶解物IC50值降低为1 271.46 μg•mL-1。R-藻红蛋白对肝癌细胞HepG-2抑制作用的IC50值为1 593.61 μg•mL-1,其酶解物IC50值降低为512.05 μg•mL-1。【结论】经木瓜蛋白酶酶解后,R-藻红蛋白酶解物具有较强的抗氧化和抑瘤活性。酶解技术可作为进一步提高R-藻红蛋白生物活性的有效手段。     

光敏蛋白脂质体的制备与生物活性

【目的】获得KillerRed蛋白（KRP）脂质体的制备配方,测定其物理化学性质及生物活性,为优化该蛋白的使用性能提供依据。【方法】用逆相蒸发法制备KRP脂质体,用荧光分光光度法测定脂质体包封率,以包封率为指标通过正交试验优化配方,并考察脂质体的形态、粒径、Zeta电位和泄漏率以及生物活性。【结果】按优化配方制得的脂质体颗粒呈球形,平均粒径为520.9 nm、Zeta电位为-83.78 mV、包封率为77.05%;不同时段脂质体对白纹伊蚊4龄幼虫毒力回归方程分别为y=3.0499x+0.0368（r=0.9771）、y=2.6003x+1.1592（r=0.9600）和y=2.7702x+1.2624（r=0.9765）,LC50值分别为42.40、30.00和22.35 μg•mL-1;脂质体透过家蚕和斜纹夜蛾表皮的效果均优于KRP,48 h后通过家蚕和斜纹夜蛾表皮的累积渗透量达24.67和20.83 μg•mm-2,分别是同时间段KRP的3.10和2.35倍。【结论】以该配方制得的KRP脂质体生物活性明显高于KRP,经皮渗透效果也优于KRP。     

果蔬中氯吡脲残留的膳食摄入风险评估

【目的】明确中国居民氯吡脲的膳食摄入风险和现有的氯吡脲最大残留限量（MRL）标准对消费者健康的保护水平。【方法】基于规范残留试验和市场残留监测的农药残留国家估计每日摄入量和国家估计短期摄入量评估方法;基于现有MRL标准的理论最大每日摄入量和理论最大短期摄入量评估方法。【结果】采用规范残留试验数据的评估结果表明,中国各类人群氯吡脲的国家估计每日摄入量在0.117-0.318 μg•kg-1 bw•d-1,只占每日允许摄入量（ADI）的0.17%-0.45%;国家估计短期摄入量在0.06-1.33 μg•kg-1 bw•d-1,只占急性参考剂量（ARfD）的0.01%-0.13%。采用市场监测数据的评估结果表明,各类人群国家估计每日摄入量在0.022-0.061 μg•kg-1 bw•d-1,仅占ADI的0.03%-0.09%;国家估计短期摄入量在0.20-0.83μg•kg-1 bw•d-1,只占ARfD的0.02%-0.08%。各类人群的氯吡脲理论最大每日摄入量为0.51-1.38μg•kg-1 bw•d-1,理论最大短期摄入量为0.64-23.25 μg•kg-1 bw•d-1。现有的氯吡脲MRL标准对消费者慢性膳食风险的保护水平为51-138倍,急性膳食风险的保护水平为43-1 564倍。【结论】中国各类人群氯吡脲残留的膳食摄入风险非常低,现有的氯吡脲MRL标准对消费者具有较高的保护水平。     

基于SERS技术的茶叶中乐果农药残留的快速检测

基于表面增强拉曼光谱方法(surface-enhanced raman spectroscopy,简称SERS)与快速溶剂提取前处理技术,建立茶叶中乐果农药残留的快速检测方法。以金纳米粒子为增强基底,分别采集不同浓度乐果溶液的表面增强拉曼光谱和不同浓度以茶叶提取液为基质的乐果溶液表面增强拉曼光谱;采用无水硫酸镁、四氯化三铁、石墨化碳对提取液进行净化处理,去除基质中叶绿素、矿物质、茶多酚、碳水化合物等物质的干扰;762、902、1 050、1 160、1 210、1 310、1 653 cm-1这7处谱峰可作为鉴定乐果农药的峰。结果表明,茶叶中乐果农药最低浓度能达到1.0 mg/L以下;对不同浓度以茶叶提取液为基质的乐果溶液表面增强拉曼光谱进行分析,发现762 cm-1处特征峰强度与乐果浓度在1~10、8~25 mg/L内具有良好的线性关系;配制3个浓度样本验证方法的准确度,平均回收率为93.89%~96.36%,相对标准差为2.59%~4.87%,均小于5.00%,说明用该方法检测茶叶中的乐果农药具有较高的准确度和精密度。     

连翘酯苷对鸡IFN-α和JAK-STAT信号通路相关因子的影响

 【目的】探讨连翘酯苷作用于鸡胚肾（CEK）细胞后,IFN-α的表达变化及JAK-STAT通路相关因子mRNA的表达变化,及连翘酯苷对IFN-α和JAK-STAT信号通路的影响。【方法】将连翘酯苷设为3个浓度（100、200和400 μg•mL-1）,采用荧光定量RT-PCR,检测IFN-α和JAK-STAT通路相关因子的mRNA表达变化;用western blotting检测IFN-α的蛋白表达情况。【结果】与正常组相比,连翘酯苷不仅显著提高了IFN-α的表达量（P＜0.05）;而且明显上调了STAT1、JAK1、IFNAR1、IFNAR2、IRF1、IRF7的表达。【结论】连翘酯苷能够在鸡胚肾细胞（chicken embryo kidney cells,CEKs） 上诱导IFN-α的表达,且能够正向调节JAK-STAT信号通路传导。     

多环境条件下大豆异黄酮主要组分的QTL定位

 【目的】利用不同定位方法,对不同环境条件下大豆异黄酮主要组分进行QTL定位研究,为大豆异黄酮分子标记辅助育种提供理论依据。【方法】以异黄酮含量有显著差异的鲁黑豆2号（3 697.24 μg•g-1）和南汇早黑豆（1 816.67 μg•g-1）为亲本构建的F5∶7-8重组自交系为材料,分析RIL群体的SSR标记多态性,结合HPLC法鉴定异黄酮主要组分含量。【结果】绘制了一张包含161个多态性SSR标记,全长3 546.54 cM的大豆遗传连锁图谱。利用ICIMapping 3.2软件的ICIM、IM和SMA 3种定位方法,共定位到4种环境下与异黄酮主要组分相关的14个QTL。【结论】3个标记区间在多个环境和多种定位方法下均被检测到,分别是Sat_003—Satt306、Satt070—Satt122和Satt571—Satt270。     

葡萄农药残留及其对葡萄酒酿造的影响

【目的】以烟台地区的3个酿酒葡萄品种为材料,分析葡萄与葡萄酒中的农药残留,比较农药残留对葡萄酒发酵过程及其质量的影响。【方法】分别采用气相-火焰光度检测器（GC-FPD）和气相-电子俘获检测器（GC-ECD）对样品中有机磷和有机氯农药进行检测。【结果】在烟台地区4个地块的赤霞珠和霞多丽葡萄品种中,均存在三唑酮,平均浓度71.09 µg•kg-1;地块1的霞多丽、地块3的赤霞珠中检测出六六六,浓度分别为2.23 µg•kg-1和4.86 µg•kg-1;地块2和地块3的2个葡萄品种中均检测出三氟氯氰菊酯,浓度在2.36-7.51 µg•kg-1,平均浓度为4.28 µg•kg-1。农药百菌清对供试的蛇龙珠葡萄酒发酵过程抑制作用最明显,当浓度高于0.20 g•kg-1时,其酒精发酵后期将出现停滞现象;供试的赤霞珠发酵结束后,葡萄原料中农药残留六六六、三唑酮、百菌清、三氟氯氰菊酯到葡萄酒中的转移率分别为32.14%、0.67%、0、0。【结论】烟台地区酿酒葡萄原料的农药残留较低,均符合中国相关标准要求;农药残留对葡萄酒的发酵过程具有一定影响,并给葡萄酒的感官质量带来不良影响;在葡萄酒酿造过程中,从葡萄原料引入的农药残留种类和含量均减少,不同种类农药残留的转移率不同。     

光活化成分α-三联噻吩对红火蚁的致死作用及对其行为的影响

 【目的】明确光活化成分α-三联噻吩（α-T）对红火蚁（Solenopsis invicta Buren）的致死作用和行为影响。【方法】采用Potter喷雾法研究α-三联噻吩经UVA光照后对红火蚁的击倒活性、致死作用及对红火蚁行走、攀附、聚集能力的影响,并应用扫描电镜技术探讨α-三联噻吩对红火蚁光活化影响的作用机理。【结果】100 μg•mL-1 α-三联噻吩经UVA光照90、120和180 min后,对中型工蚁的击倒率分别为93.08%、98.29%和100%,显著高于药剂黑暗处理90、120和180 min后对中型工蚁的击倒率7.41%、18.52%和25.93%;100 μg•mL-1 α-三联噻吩经UVA光照处理30 min,并黑暗放置1、30、60、90、120、150和180 min后,中型工蚁的死亡率分别为6.25%、10.42%、18.75%、29.17%、37.50%、43.75%和52.08%;行走率分别为25.26%、18.75%、10.67%、6.58%、2.83%、2.08%和0;对倒置一次性塑料杯的附着率分别为20.83%、12.50%、6.17%、4.17%、2.01%、1.96%和0;聚集率分别为20.78%、17.19%、10.94%、15.63%、14.06%、27.08%和37.50%;100 μg•mL-1 α-三联噻吩UVA光照处理30 min后,黑暗放置30 min,中型工蚁触角棒节的毛形感受器和刺形感受器的形态发生显著变化,大部分从中下部发生弯曲,呈倒伏状态,并出现明显指向杂乱的现象。【结论】α-三联噻吩对红火蚁中型工蚁具有良好的击倒活性和一定的致死作用,显著降低其行走能力、对杯壁的攀附能力及聚集能力,显著改变触角感受器的形态及指向,光活化成分有望成为防治红火蚁的安全环保新手段。     

氟罗沙星残留检测间接竞争ELISA试剂盒的研制

【目的】利用蛋白质连接技术合成氟罗沙星（FLE）人工抗原,制备FLE高亲和力抗体,通过建立、优化FLE的icELISA检测方法研制出快速、灵敏的FLE残留检测间接竞争ELISA试剂盒。【方法】用DCC法偶联FLE和载体蛋白BSA合成免疫原FLE-BSA,用混合酸酐法偶联FLE和载体蛋白OVA合成包被原FIE-OVA,通过紫外扫描法（UV Scan）和聚丙烯凝胶电泳法（SDS-PAGE）鉴定人工合成抗原。选择经初步鉴定成功合成的FLE-BSA免疫SPF级6-7周龄Balb/c雌性小鼠5只,采用多点免疫法,对小鼠背部皮下4-6点注射免疫,免疫剂量为30 μg/只,初免,用FLE-BSA PBS溶液与等体积FCA混合乳化后免疫;20 d后用FLE-BSA PBS溶液与等体积FIA混合乳化后免疫,免疫间隔3周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠多克隆血清,建立、优化FLE的icELISA检测方法,确定其包被浓度、包被时间、封闭液选择、封闭时间、抗体工作浓度、二抗稀释度、底物显色时间等条件,制备出FLE快速检测试剂盒,同时测定该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度以及特异性等指标,并与高效液相色谱法做相关性比较,同时对市场上购买4个批次的氟罗沙星药品含量进行了实际测定,以确证试剂盒在实际应用中的质量。【结果】通过上述蛋白质连接技术所制备的免疫原经紫外扫描法和聚丙烯凝胶电泳法鉴定,结果显示BSA与FLE偶联后,FLE-BSA波峰整体出现右移且凝胶上BSA的泳动速度大于FLE-BSA,初步证明人工合成抗原偶联成功。通过间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定5号小鼠多抗血清得到其效价大于2.5×104,抑制价为162.18 ng•mL-1。通过优化FLE icELISA检测方法,其工作条件：包被浓度：5 μg•mL-1;抗体工作浓度：1﹕6400;二抗稀释度：1﹕1000;底物显色时间：10 min。所制备的试剂盒灵敏度为16.22 ng•mL-1,标准曲线回归方程为y=－0.3627x + 1.3517（R2 = 0.9956）,与同系药物及其它药物均无明显交叉反应,阳性猪肝样的回收率在67.5%-87.9%,平均78.7%,变异系数在9.34%-10.7%,平均10.0%;阳性猪肉样的回收率在74.0%-88.2%,平均81.42%,变异系数在8.3%-10.4%,平均9.48%;平均变异系数均小于15%;在500、250、150、75、30 ng•mL-1 5个标准浓度 B/B0的批内变异系数在3.39%-6.68% ,批间变异系数在4.69%-9.67%。批内和批间平均变异系数分别为5.07%和7.44%,且与HPLC方法具有良好的一致性(R2=0.9988),通过实际测定其结果基本符合2010年版《中国药典》中所规定的含量要求(90%-110%),进一步说明二者具有良好的相关性以及FLE-Kit的准确性。【结论】首次利用两种方法分别合成FLE免疫原和包被原,利用所制备的抗FLE血清建立并优化FLE残留icELISA检测方法,制备出FLE快速检测试剂盒。该试剂盒具有灵敏、准确、简便、快速的特点,为氟罗沙星免疫学快速检测方法的建立奠定了坚实的基础。     

高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮的含量

【目的】建立一种高效液相色谱法同时测定柑橘果实中18种类黄酮（圣草次苷、二氢槲皮素、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆苷、槲皮苷、圣草素、香峰草苷、枸橘苷、柚皮素、木犀草素、山奈酚、香叶木素、橙黄酮、川陈皮素、橘皮素）的含量。【方法】 色谱柱为ZORABX SB-C18（4.6 mm×250 mm, 5 μm）,流动相为甲醇-甲酸-水,梯度洗脱,流速为0.7 mL•min-1,柱温25℃,检测波长黄烷酮为283 nm、黄酮和多甲氧基黄酮为330 nm、黄酮醇为367 nm。【结果】 18种类黄酮在42 min内完全分离,线性范围为62.4—960 mg•L-1（r=0.9996—1.0000）,定量限为0.05—0.133 μg•mL-1,回收率为88.70%—104.76%,相对0.33%—3.05%（n=6）。【结论】该方法简便、快速、准确、可靠,适合柑橘果实中18种类黄酮的含量测定。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

QuEChERS前处理结合HPLC-MS/MS法分析氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留

【目的】研究氯虫苯甲酰胺在蔬菜上和土壤中的残留降解动态,制定氯虫苯甲酰胺制剂防治蔬菜害虫的最佳施用量和安全间隔期。【方法】采用QuEChERS前处理方法结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）测定20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂中氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的残留降解动态和最终残留量。【结果】氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的添加回收率分别为81.25%-92.05%和82.92%-93.38%;HPLC-MS/MS定性分析表明甘蓝和土壤中的残留物质为氯虫苯甲酰胺。氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中降解动态符合一级动力学指数模型,在甘蓝上和土壤中的半衰期分别为7.66和6.86 d。20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂以0.045 g•m-2施药时,它在甘蓝和土壤中的最终残留浓度分别为未检出和0.0071 mg•kg-1;0.090 g•m-2剂量施药时,它在甘蓝和土壤中的最终残留浓度分别为0.0063和0.1004 mg•kg-1。【结论】20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂以0.045和0.090 g•m-2剂量施药时,氯虫苯甲酰胺在甘蓝和土壤中的最终残留浓度符合残留要求,可以安全使用。