火龙果EST-SSR分子标记反应体系的建立与优化

基于火龙果转录组测序序列设计引物,以生物学性状差异明显的11份火龙果种质DNA为材料,采用正交试验设计,对影响火龙果EST-SSR-PCR扩增的2×Taq PCR Master Mix、引物及模板DNA浓度等因素进行了优化,在此基础上对变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度及上样量进行筛选确定。以期建立适合火龙果的EST-SSRPCR最佳反应体系。结果表明,优化后的火龙果EST-SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:10μL混合反应体系含基因组DNA 30 ng、6μL 2×PCR Mix和0.6μL(10-5mol/L)的EST-SSR引物。在聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中,10%的变性聚丙烯酰胺凝胶质量浓度、2.5μL上样量扩增效果最佳。该体系的建立可为今后利用EST-SSR标记对火龙果遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供基础。     

山楂PCR－SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA,对PCR-SSCP引物进行筛选,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]rop B、rop L、rpo C1、ITS2、psb A-trn H 5对引物适用于山楂PCR-SSCP分析。电泳时,采用6%聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),4℃恒温,200 V恒压,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%Na OH)变性15 min,电泳缓冲液为0.5×TBE,电泳3~4 h可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系的优化

[目的]优化仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系。[方法]以25份仁用杏和3份食用杏为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术筛选出多态性高、可重复的SSR位点。并比较不同因子对电泳体系的影响,探索仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系。[结果]仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系为：聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6%,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29∶1,1000V下电泳2～3h,0.1%AgNO3染色15min后显影。[结论]该优化体系为仁用杏资源微卫星标记遗传分析奠定了技术基础。     

仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系的优化

[目的]优化仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳体系。[方法]以25份仁用杏和3份食用杏为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术筛选出多态性高、可重复的SSR位点。并比较不同因子对电泳体系的影响,探索仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系。[结果]仁用杏微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系为：聚丙烯酰胺凝胶的浓度为6%,丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29∶1,1000V下电泳2～3h,0.1%AgNO3染色15min后显影。[结论]该优化体系为仁用杏资源微卫星标记遗传分析奠定技术基础。     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件.[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA.从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物.[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-tmH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析.电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1％NaOH)变性15min,采用6％的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3～4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱.[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础.     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化（英文）

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA。从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-trnH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析。电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%NaOH)变性15min,采用6%的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3~4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCRSSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

木薯SSR标记非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以木薯品种为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行木薯重要农艺性状基因的引物筛选。通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个木薯微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系：TEMED用量为80μL,10％AP用量为1200μL,电泳时间为60～90min。     

黄瓜SRAP-PCR反应体系的建立

为了建立黄瓜适宜的SRAP(相关序列多态性)反应体系,以长形白皮少刺黄瓜B-2-2和圆形白皮黄瓜Y-3为材料,分析了不同来源的Taq酶及其浓度、Mg2 浓度、dNTP浓度、DNA模板浓度、引物浓度对扩增结果的影响,并比较了琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,在12.5μL反应体系中,Taq酶适用Takara酶,其最适用量为0.5U;DNA模板最适浓度为30 ng,Mg2 最适浓度为2.0 mmol/L,引物最适浓度为0.96μmol/L,dNTP最适浓度为200μmol/L。6%的变性聚丙烯酰胺电泳检测扩增产物效果比琼脂糖检测效果好。用不同黄瓜材料的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,6对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带。因而建立的黄瓜SRAP反应体系稳定可靠。     

黄瓜SSR-PCR反应体系的优化

采用L9(34)正交试验设计,研究了黄瓜SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,并比较了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明,最适反应体系为:在20μL体系中包括dNTP 200μmol.L-1、Primer 0.4μmol.L-1、Mg2+2.5μmol.L-1、Taq酶0.5μmol和模板DNA60 ng。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物结果更准确。     

猪微卫星多态性两种检测方法的比较研究

 为了确定一种安全、有效的检测猪微卫星多态性的实验方法,采用两种电泳和两种染色方法对大白猪基因组DNA进行了6个微卫星座位的PCR扩增,并将扩增产物在2.5%的琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,然后又在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,AgNO₃染色。结果表明两种方法检测出的等位基因数目和基因多态性水平存在差异,8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳在区分微小差异片段能力上明显优于2.5%的琼脂糖凝胶电泳。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

向日葵食用蛋白的提取和SDS-PAGE电泳技术研究

以向日葵种子为材料,采用SDS-PAGE电泳技术,以不同电泳条件对23种向日葵食用蛋白进行电泳谱带分析试验,研究不同电泳条件下向日葵食用蛋白的谱带变化,以选择出最佳的电泳条件。结果显示,最佳试验条件为:按照质量与体积比1∶3的比例用去离子水在4℃条件下30min提取水溶性蛋白。电泳时,在4℃条件下进行,凝胶板厚度1mm,分离胶浓度8%,浓缩胶浓度5%,电压300V,加样量控制在10μL。     

银染聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系的优化

【目的】针对银染PAGE实验中常出现的背景颜色深、条带弥散、凝胶变形及条带不整齐等问题进行归纳总结并提出优化方法。【方法】以甘蓝型油菜基因组DNA为研究对象,通过PAGE电泳后银染并调整试剂配方、实验条件,筛选出适合实验的技术体系。【结果】甲醇浓度、电压稳定性、电泳温度、气泡等显著影响实验结果。甲醛浓度过高(1.25%)时,虽所需染色时间短,但凝胶背景深;甲醛浓度过低(0.001 25%)时,背景浅但条带淡,需要长时间染色;电压不稳定会造成条带弥散;电泳温度过高,导致凝胶变形,条带弯曲;凝胶中的气泡会扰乱DNA条带的形状;NaOH浓度在0.875%~1.375%,染色结果无明显差异。【结论】甲醛用量4 mL(1%)、保持稳定电压、在冰浴中电泳、制胶时及时赶走所有气泡,可得到凝胶背景浅、条带清晰且正常的结果。     

龙眼AFLP银染体系的建立与优化

[目的]优化龙眼AFLP银染体系中的影响因素。[方法]以23份龙眼品种和2份龙眼近缘植物龙荔为试材,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系中的几个影响因素(DNA提取、酶切与连接、电泳与银染)进行研究,建立起龙眼AFLP银染分析体系。[结果]用紫外分光光度计检测样品DNA质量和浓度,发现提取的DNA吸光度A260/A280比值在1.8左右,A260/A230的比值大于2.0,说明所提取的DNA样品纯度较高,无蛋白质或盐类的污染。酶切与连接中采用37℃水浴5 h,然后转入65℃水浴2 h的方法能保证酶切充分,又能防止酶切过度。电泳和银染时用4℃预冷的显影液进行显影,可以降低显影速度。[结论]采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,重复性强,适宜用作龙眼品种鉴别和遗传多样性分析。     

碳离子辐照对甜高粱幼苗保护酶同工酶表达的影响

[目的]分析碳离子辐照对甜高粱幼苗叶片中保护酶同工酶的影响。[方法]以甜高粱品种KFJT-CK为对照,以经碳离子辐照选育的早熟突变株KFJT-1为试材,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)对幼苗叶片中的过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶谱进行了分析。[结果]突变后代KFJT-1与对照KFJT-CK相比,POD同工酶酶谱基本相同,说明碳离子辐照并未使甜高粱POD同工酶的表达发生明显的变化;SOD同工酶酶谱的条带数相同,只是条带的颜色深浅有所差异,说明碳离子辐照仅使SOD同工酶的表达量有所差异;EST同工酶增加了1条新谱带,说明碳离子束辐照使甜高粱EST的表达发生了变异。[结论]碳离子辐照对甜高粱幼苗叶片中POD的影响很小,对SOD有较微弱的作用,而对EST的同工酶谱有很大的影响。     

烟草AFLP银染分析体系的建立

以14个烟草品种为试材,初步建立了适合于烟草AFLP分析的银染分析体系:烟草基因组的DNA提取采用CTAB法;地酶切连接同步进行;预扩增选用E+A和M+C引物;选择性扩增选用E+3和M+3引物;扩增产物利用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳,后用银染法检测。采用优化的体系,20对引物组合扩增出清晰的烟草AFLP图谱。     

圆果黄麻成熟叶片总DNA提取及SRAP扩增体系的建立与优化

采用改良的CTAB法从圆果黄麻成熟叶片中提取基因组DNA,对DNA进行电泳检测、含量测定和SRAP分析,并对黄麻SRAP-PCR反应体系中主要影响因子进行了优化,建立了最佳反应体系.结果表明,改良的CTAB法能够提取高质量的DNA,DNA纯度和完整性都较好,经紫外分光光度计测定,D260nm/D280nm均在1.7-1...     

NAU-PAGE技术与玉米种子纯度测定

NAU-PAGE（不连续醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术解决了准确、快速测定玉米种子纯度问题。玉米种子贮藏蛋白在杂交种内呈双亲共显性,且主要存在于种胚内。因此,用此方法测定玉米种子纯度不受种子大小、正反交的影响。虫害后只要有胚存在就不影响玉米种子纯度测定。种子萌动后,蛋白质谱带开始模糊,不利于纯度测定。