2种基因漂移检测方法对比及其影响因素分析

[目的]针对田间基因漂移常用的PCR检测或蛋白检测方法,确定2种方法检测结果的一致性及其环境影响因素。[方法]通过设计环境因素和对大量样本使用PCR检测和蛋白检测方法,对3个处理（风力处理、蜜蜂处理和空白对照）下3个品种共计1769个样本进行了双重检测。[结果]田间基因漂移存在基因转入但不表达的现象,即PCR检测和蛋白检测结果并非完全一致。环境因素中,风力处理和蜜蜂处理对基因表达无显著影响,但蜜蜂处理的基因表达率高于风力处理。[结论]为基因漂移的精确检测提供了参考。     

大豆高代新品系草甘膦抗性的检测与筛选

[目的]对大豆杂交高代品系草甘膦抗性进行检测,并从中筛选综合性状优良的抗草甘膦大豆新品系。[方法]以普通大豆晋大73为母本,抗草甘膦转基因大豆RR1为父本进行杂交,采用常规育种方法,早代以农艺性状为标记进行选择,F7代对34个后代品系进行蛋白脂肪含量测定和大田草甘膦抗性测定,并以大豆凝集素基因(lectin)为内置标准,对大豆外源CaMV35S启动子、NOS终止子、抗草甘膦基因(CP4-EPSPS)进行PCR检测。[结果]27个品系对草甘膦具有完全抗性,且均检测到CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因;5个品系未检测到CP4-EPSPS基因,田间测定也均为完全不抗;另有2个品系PCR检测结果一致,但田间抗性测定1个为完全抗性、1个为完全不抗。[结论]田间测定结果与PCR检测结果基本一致,符合率达到了94.1%。筛选出27个具备抗草甘膦特性的新品系,其中4个品质优良,表现为超亲优势。     

家蚕moricin基因家族的诱导表达

[目的]节究不同外源微生物对家蚕moricin抗菌肽的诱导表达。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,RT—PCR检测moricin基因被诱导后在家蚕脂肪体的表达。[结果]结果表明,moricinB1和moricinB3基因有高的诱导表达水平,moricinA1和moricinB2基因表达差异不明显。[结论]MoricinB1和MoricinB3蛋白可能对大肠杆菌具有抗菌     

伪狂犬病病毒野毒感染快速检测方法的比较

[目的]对猪群伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染的快速检测方法进行比较.[方法]采集肥育猪的血清和扁桃体,用ELISA方法检测血清中PRV-gE蛋白抗体,用常规PCR方法和荧光定量PCR方法检测血清与扁桃体中的PRV-gE基因,比较分析猪群PRV野毒感染情况.[结果]结果显示,荧光定量PCR方法对血清与扁桃体中的PRV-gE基因的检出率均高于常规PCR方法,gE基因在扁桃体中的检出率高于血清,而gE蛋白抗体检出率高于gE基因检出率.[结论]PRV-gE蛋白抗体检测敏感性高于gE基因检测,荧光定量PCR对gE基因的检测敏感性高于常规PCR,gE基因在扁桃体中的检测敏感性高于血清,为猪群PRV野毒感染快速检测方法的选用提供了试验依据.     

转基因水稻外源基因向稗草的漂移研究

[目的]研究转基因水稻中外源基因向同科杂草稗草的基因漂移情况。[方法]利用农杆菌介导的方法,获得稳定遗传的转hpt基因水稻株系,对转基因水稻田中自然生长和人工种植的稗草种子进行PCR检测,确定是否含有转基因成分。[结果]通过对多株杂草稗种子获得的22 000株幼苗的PCR检测,均未能检测到外源基因的存在。[结论]未发现稳定遗传的转基因水稻中外源基因向稗草的漂移。     

奶牛隐性乳房炎多重PCR检测方法研究

[目的]建立一种快速、准确和特异性强的奶牛隐性乳房炎检测方法。[方法]采用多重PCR从基因水平上对70份临床疑似奶牛隐性乳房炎感染样本进行检测。[结果]多重PCR方法检测隐性乳房炎阳性样品数为58份,阳性检出率为82.5%;传统生化方法检测阳性样品数为53份,阳性检出率为75.5%,两者的阳性符合率为92%。[结论]成功地建立了一种快速、特异性强的奶牛隐性乳房炎多重PCR检测方法。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

水稻3型金属硫蛋白基因的分离和表达研究

[目的]对从水稻幼苗中分离的2个3型金属硫蛋白基因OsMT-I-3a和OsMT-I-36的结构进行了分析,并对其表达模式进行了检测。[方法]利用Blast搜索水稻数据库,设计引物并利用RT—PCR的方法克隆OsMT-I-3基因cDNA全长。通过多重比对等方法对其基因和蛋白结构进行了分析。利用Northem杂交对这两个基因的组织表达模式和环境应答模式进行了检测。[结果]OsMT-I-3a和OsMT-I-3b分别编码62和65个氨基酸的多肽,具有典型的3型金属硫蛋白的半胱氨酸分布模式。OsMT-I-3a基因在叶片中没有检测到表达,OsMT-I-3b在叶片中高表达,且各种非生物胁迫因素会影响两种基因的表达模式。[结论]I类3型2个水稻MT基因可能参与水稻多种环境胁迫的信号通路,在水稻抗非生物胁迫过程中起作用。     

不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响

[目的]研究不洁贮藏对葡萄果肉衰老相关基因表达的影响。[方法]以巨峰葡萄果实为材料,应用实时荧光定量PCR技术对不同处理的相对表达量进行测定。[结果]ACC氧化酶基因、ACC合成酶基因、苯丙氨酸解氨酶基因表达量明显上调;脱落酸调控基因表达量明显下调。[结论]该试验为从基因水平上研究葡萄保鲜机理奠定了基础。     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测(英文)

[目的]克隆蜜蜂(Apis mellifera)TPI基因,并进行生物信息学预测。[方法]利用电子克隆方法获得蜜蜂磷酸甘油醛异构酶(Triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白的等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测。[结果]蜜蜂TPI基因全长为1768bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),所编码蛋白的等电点为8.515。二级结构预测表明TPI蛋白属于α/β蛋白。[结论]利用蜜蜂表达序列标签数据库(EST)电子克隆蜜蜂新基因的研究工作有一定的现实意义,为进一步在分子水平研究蜜蜂提供更多的参考。     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达(英文)

[目的]对 cry 基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌 Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据 NCBI 数据库信息设计引物序列,采用PCR 技术从抗虫棉基因组 DNA 中扩增出抗虫基因 cry 的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)菌株中,利用 pGEX 原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同 IPTG 浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因 cry 的两段保守序列,长度分别为304 和 853 bp;SDSPAGE 检测结果显示,经 IPTG 诱导后重组质粒 pGEX4t1304 和 pGEX4t1853 成功地表达了大量 GST 融合蛋白,分子量分别为39 和 62.4 kDa,与预期结果一致;确定了 IPTG 最佳诱导浓度为 0.15 mmol/L,最佳诱导时间为 7 h。[结论]为今后检测转 Bt 基因农作物奠定了基础。     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

cry基因保守序列克隆及其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的表达

[目的]对cry基因保守序列进行克隆,并使其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。[方法]根据NCBI数据库信息设计引物序列,采用PCR技术从抗虫棉基因组DNA中扩增出抗虫基因cry的保守序列,构建重组载体并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中,利用pGEX原核表达系统诱导蛋白表达。同时,分析了不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响。[结果]扩增出抗虫基因cry的两段保守序列,长度分别为304和853 bp;SDS-PAGE检测结果显示,经IPTG诱导后重组质粒pGEX-4t-1-304和pGEX-4t-1-853成功地表达了大量GST融合蛋白,分子量分别为39和62.4 kDa,与预期结果一致;确定了IPTG最佳诱导浓度为0.15 mmol/L,最佳诱导时间为7h。[结论]为今后检测转Bt基因农作物奠定了基础。     

Bt抗虫水稻转育后代两种筛选方法的比较

[目的]通过比较分子标记辅助选择和除草剂抗性筛选两种检测方法的优缺点,为快速、准确、经济有效地选择抗螟虫水稻转育后代提供依据.[方法]用分子标记检测和除草剂抗性筛选两种方法,对不同组合的抗螟虫转育后代进行筛选,同时采用ELISA检测方法对筛选的抗性株系测定杀虫蛋白含量,比较两种筛选方法的准确性.[结果]在以T1C-19为供体亲本的4个组合169个单株中,两种筛选方法的符合率达到98.2%;而以T2A-1为供体亲本的3个组合141个单株中,两种筛选方法的符合率达到98.6%.在随机选择的经两种筛选方法鉴定均为阳性的144个单株中,均含有对应Bt抗虫基因的杀虫蛋白表达量,与亲本T1C-19、T2A-21相比,Bt抗虫水稻转育后代中个别单株的Bt蛋白含量出现大幅度下降或上升的现象.[结论]分子标记检测和除草剂抗性筛选对抗螟虫水稻转育后代的选择均有很高的准确性:分子标记检测准确可靠,且不受环境影响,但费用相对高;除草剂抗性筛选法耗费低、简便易行,但易受雨天影响.在筛选的过程中可根据现有的条件做出适宜选择.     

水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因表达载体的构建

[目的]构建水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[方法]利用长片段PCR在抗白叶枯病水稻品种扎昌龙中扩增长10.6 kb的候选基因,将其通过Asc I单酶切克隆至植物表达载体pCAMBIA1300中,并对阳性克隆进行质粒PCR、酶切检测和测序分析。[结果]试验成功构建了水稻白叶枯病抗性基因Xa31(t)候选基因的表达载体。[结论]该研究为进一步研究Xa31(t)基因的功能奠定了基础。     

昆虫抗冻蛋白转基因植物表达载体的构建及转基因棉花T_1代的检测

【目的】为了提高转基因质粒的表达效果,基于pCAMBIA2300植物表达载体,改造并构建含有小胸鳖甲抗冻蛋白基因Mpafp149、双CaMV35S启动子、Ω增强子和NOS终止子的高效植物表达载体pCN2300-Mpafp149。【方法】将抗冻蛋白基因采用不同的注射方法对新疆北疆棉区主栽棉花品种进行了花粉管通道法遗传转化。对获得的转基因棉花T_1代植株进行PCR及RT-PCR检测。【结果】对Mpafp149、卡那霉素抗性基因NPTⅡ及CaMV35S进行PCR检测,3个结果的阳性一致率达到了80%。此外,通过磨短进样器针头的长度可大幅提高成铃率,直接注射新陆早42号的成铃率达到了37.59%。【结论】小胸鳖甲抗冻基因Mpafp149已转入T_1棉花。通过使用改造的进样器注射可大幅提高成铃率。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因的克隆及原核表达

[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cry1Ac15基因序列。[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点。以Ly30质粒DNA为模板扩增cry1Ac全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有cry1Ac基因的重组质粒pUCLy1Ac。[结果]cry1Ac基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cry1Ac3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134 kD蛋白带。[结论]诱导表达的cry1Ac蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性。     

转双Bt基因巨霸杨外源基因表达及抗虫性检测

为提高转基因杨树中Bt基因的表达效率并扩大抗虫谱,以同时转入Cry1Ac和Cry3A基因的转双Bt基因巨霸杨(Populus deltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)株系1年生苗为材料,对外源基因的表达和抗虫性进行检测。经PCR检测,证明目的基因已被整合到巨霸杨基因组中。利用荧光定量PCR和ELISA技术检测了4个转基因株系叶片中Bt基因的转录丰度和毒蛋白表达量。结果表明:不同株系间Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因的转录丰度;2种Bt毒蛋白表达量在各株系间存在显著差异,Cry3A毒蛋白质量分数均显著高于Cry1Ac毒蛋白质量分数。各株系对鳞翅目害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)幼虫抗虫效果不明显,且无显著差异;对鞘翅目害虫柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)表现出极高抗虫效果,且均显著高于转单基因Cry3A 741杨高抗株系CC84,不同株系间存在显著差异。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。