山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

江苏地区2株山羊痘病毒的分离与鉴定

为对江苏部分地区羊场羊痘病毒进行有效的监测和防控,及时了解病毒遗传进化趋势,降低规模化养羊业的风险,本研究从江苏部分地区养羊场采集疑似羊痘病羊的皮肤丘疹、水疱或脓疱组织病料样品,分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜、胎羊睾丸细胞(LT)和牛肾细胞(MDBK),观察鸡胚病变和细胞病变情况。同时通过PCR方法扩增羊痘病毒p32基因进行序列分析,并进行p32基因限制性片段长度多态性分析。结果显示,接种鸡胚绒毛尿囊膜形成典型的痘斑,胚体出血;系统进化分析显示,两株分离株属于山羊痘病毒(GTPV);限制性片段长度多态性分析结果也显示符合GTPV的特征。本研究所分离到的2株GTPV,为当地制定山羊痘的防控策略提供依据。     

一株绵羊痘病毒的分离鉴定

对黑龙江省齐齐哈尔地区疑似羊痘病毒(CaPV)感染的病例通过临床症状进行初诊后,采集病羊皮肤丘疹、脓疱等病料,接种于牛肾细胞(MBDK),盲传5代,观察细胞病变情况;同时将病料接种于9日龄鸡胚的绒毛尿囊膜,观察鸡胚病变情况;利用PCR方法扩增病毒的P32基因;扩增产物经测序后构建系统进化树。结果:细胞出现规律而明显的细胞病变;鸡胚绒毛尿囊膜观察到特征性痘斑;扩增的P32基因片段长度为972 bp;系统进化树结果显示本研究分离的CaPV与其他绵羊痘病毒(SPPV)聚集在一个分支,证明该病毒为SPPV。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

山羊痘病毒粒子的电子显微镜观察

本研究室2003年以来对山羊痘病毒感染多种细胞进行了透射电镜观察。在感染的皮肤和黏膜上皮细胞浆中观察到大量不同成熟阶段的典型山羊痘病毒粒子，病毒粒子也见于巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞胞浆内，甚至少量散在血管腔中。用山羊痘病毒分离物感染鸡胚绒毛尿囊膜形成痘斑，其上皮细胞和成纤维细胞中也可见成熟和不成熟的病毒粒子，同时感染BHK-21细胞也观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

鸡传染性法氏囊病毒增殖和纯化方法的研究

本试验通过IBDV标准毒株(IBDVBC6/85F4)和IBDV河北分离株分别接种于SPF鸡胚以及鸡胚成纤维细胞(CEF)。吸取接毒后2～5天内死亡鸡胚的尿囊液和绒毛尿囊膜,及细胞病变达到80%时的细胞培养液。经反复冻融,利用氯仿沉淀病毒,聚乙二醇6000浓缩病毒,蔗糖梯密度低温超速离心和葡聚糖G-200凝胶柱过滤等方法纯化病毒。经分光光度计检测,病毒的蛋白含量为1.377毫克/毫升,琼脂扩散试验证实被检抗原为IBDV。     

山羊痘病毒的分离与鉴定

为了对山羊痘病毒的分离与鉴定进行分析,笔者针对南方某地区发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒分离与鉴定的试验研究。通过研究发现,利用PCR扩增作用可以获得异性DNA条带,随着结转代数的增加,可以利用山羊痘病变皮肤以及鸡胚绒毛尿囊膜的变化作为山羊痘病毒分离与鉴定的方法。     

鸡传染性法氏囊病的实验室诊断

采集病死鸡法氏囊经处理后绒毛尿囊膜途径接种5枚SPF鸡胚,接种胚均于接种后48~96 h死亡,死亡胚病变特征为体表和皮下出血,胚水肿,肾脏出血,肝脏有坏死灶,心肌苍白。琼扩试验结果显示法氏囊样品孔、绒毛尿囊膜样品孔与标准血清孔间均可出现明显的沉淀线,说明样品中含有传染性法氏囊病病毒。根据实验室检查情况,诊断为鸡传染性法氏囊病。     

鸡传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

为掌握发病鸡场的致病原,将临床病料接种SPF鸡胚分离得到一株病毒,通过胚体病变特征、血凝试验、RT-PCR检测、动物回归试验等对该病毒进行了鉴定,结果显示:病料处理接种鸡胚后48~144 h内鸡胚全部死亡,剖检死亡鸡胚可见胚体存在蜷缩、发育矮小等特异性病痕,收获的鸡胚尿囊液无血凝性,RT-PCR检测为鸡传染性支气管炎病毒阳性,动物回归试验中接种的SPF雏鸡可复制出现鸡传染性支气管炎的典型症状。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

Preliminary characterisation of the sersenk strain of goat pox virus

The Sersenk strain of goat pox virus first isolated in Iraq, grew on chorioallantoic membranes (CAM) of developing chicken embryos producing generalised large pocks, 2 to 3 mm in diameter, on the third day post-inoculation. The virus killed the inoculated embryos. Replication of the virus in primary cultures of lamb testis cells induced a cytopathic effect (CPE) and plaque formation characteristic of pox viruses. It was antigenically related to reference strains of goat pox and sheep pox viruses. The virus was sensitive to ether and chloroform, failed to agglutinate erythrocytes and was strictly pathogenic to goats.     

羊痘病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因序列分析及其在鉴别病毒种属上的作用

为明确G蛋白偶联趋化因子受体(GpCR)基因在羊痘病毒种属鉴别中的作用,本实验对3株绵羊痘病毒(SPV)和2株山羊痘病毒(GPV)弱毒疫苗株的GpCR进行了克隆测序,并与GenBank中登录的21个羊痘病毒属成员相关序列进行了比对。核酸同源性分析表明SPV不同毒株之间同源性达到99.5%～99.8%;GPV之间同源性达到98.8%～99.8%;GenBank上公布的疙瘩皮肤病病毒(LSDV)之间同源性达到100%。而GPV、SPV和皮肤疙瘩病毒两两比对的同源性仅达到94.2%～95.9%。对GpCR的系统进化树分析可以看出GPV、SPV和LSDV分别位于不同的进化分枝上,而GPV与LSDV具有更近的亲缘关系。GpCR基因在鉴别GPV属和流行病学分析中具有重要价值。     

山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达与细胞凋亡的相关性

以贵州本地分离纯化的山羊痘病毒为试验材料,感染Vero细胞,通过台盼蓝、吖啶橙/溴乙锭荧光染色分析细胞的死亡及凋亡比例;经特异性PCR从山羊痘病毒基因组中分离出山羊痘病毒抗凋亡蛋白样基因,基因长531bp,含有完整的编码框,与绵羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的相似性为97%,因此确定为山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因。进一步研究山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因在Vero细胞中的表达,结果显示,病毒感染Vero细胞24h时没有检测到凋亡现象,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的mRNA水平最高;感染48h时,Vero细胞的凋亡率上升到13%,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量随之下降。结果表明,山羊痘病毒抗凋亡蛋白基因的表达量与Vero细胞的凋亡呈负相关,有助于病毒在细胞内的生存和侵染等过程。     

山羊痘病变的超微病理学研究

对发生在贵州省的山羊痘病变进行了透射电镜观察。在感染的皮肤和肺上皮细胞的胞浆内发现有大量不同成熟阶段的典型的山羊痘病毒颗粒。病毒颗粒也可见于巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的胞浆内，甚至少量在血管腔内。受感染的细胞除可见胞浆内散在的病毒颗粒或形成病毒包涵体外，通常可见细胞水肿，线粒体肿胀，内质网和高尔基复合体扩张。一个有趣但十分重要的发现是，有髓神经纤维也被病毒和被感染的巨噬细胞所波及，并可见节段性脱髓鞘以及轴索和雪旺氏细胞的变性。在山羊痘痘疹材料感染鸡胚绒毛尿囊膜痘斑的上皮细胞和成纤维细胞中也可见成熟和不成熟的病毒颗粒。     

贵州省首次暴发山羊痘的诊断研究

山羊痘于 2 0 0 2年 1 0月在贵州省首次流行并被确诊。本次疫病以皮肤、呼吸道及消化道粘膜发生痘疹为主要特征 ;取病料经绒毛尿囊膜接种鸡胚传代 ,F2 绒毛尿囊膜明显增厚 ,在接种部位形成明显的痘斑。经病理组织学检查 ,患病皮肤在光学显微镜下可见细胞浆内出现嗜酸性包涵体。电子显微镜观察到典型的痘病毒粒子 ,细菌学检查阴性。为此 ,这次暴发流行的疫病确诊为山羊痘     

贵州省山羊流产的病原学鉴定

为了解贵州省山羊流产与山羊痘的相关性,采用琼脂扩散试验和PCR法对本省10个市(县)流产羊群的血清和病料样本进行山羊痘抗原抗体及病原核酸检测,同时血清进行布氏杆菌抗体检测,流产胎儿病料进行羊流产亲衣原体病原核酸检测。结果发现山羊痘羊群流产率达37.1%(4329/11660),山羊痘血清抗体阳性率为38.2%(34/89),抗原阳性率为72.7%(32/44),流产胎儿山羊痘病毒核酸检出率为83.3%(10/12),发病羊群未检出布氏杆菌和羊流产亲衣原体感染。结果表明,山羊流产与山羊痘感染有一定关系,提示在山羊养殖中应加强饲养管理,防止山羊痘感染引起孕羊流产。     

A simple technique for preparation of chicken-embryo-skin cell cultures

A simple, rapid technique was developed for preparing chicken-embryo-skin cell cultures utilizing trypsinization of the skin of intact 12-day-old chicken embryos. When cell cultures were inoculated with fowl pox virus, those that consisted of at least 80% epithelial cells yielded a higher virus titer than fibroblast cell cultures.