青海细毛羊羊痘病毒的PCR诊断与病原分离鉴定

为对青海细毛羊临床疑似羊痘病毒感染病例进行确诊,并对病原进行分离与鉴定,将发病羊的皮肤痘疹和水疱等组织病料分别进行PCR检测和接种绵羊睾丸细胞,PCR检测结果为阳性,接种病料的绵羊睾丸细胞表现出了明显的、规律性的细胞病变,且分离毒株能被羊痘病毒阳性血清所中和,其P32基因核苷酸序列与Gen Bank上登录的绵羊痘病毒P32基因序列同源性达99.1%~100%。     

山羊痘病毒NM株的分离鉴定

从内蒙古牛场疑似山羊痘病毒感染的病羊中分离到1株病毒,命名为NM株。取病羊的皮肤痘疹和水疱作病料样品,分别接种BHK-21传代细胞和10日龄SPF鸡胚。结果表明,BHK-21细胞出现了明显的、规律的细胞病变,鸡胚接种部位出现了明显的痘斑;NM株细胞毒和胚毒均能够被山羊痘病毒阳性血清所抑制。利用1对山羊痘病毒特异性检测引物对NM株病毒进行PCR扩增,获得445 bp片段,与预期大小一致。将扩增产物提纯后克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定正确后,对阳性克隆株进行序列测定,结果表明,NM株的基因片段与已发表的山羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.2%~100%之间。     

山羊痘病毒的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究对2003年广西部分地区山羊群发生的疑似山羊痘进行了病毒分离鉴定及生物特性的研究。取疑似山羊痘病羊的皮肤丘疹、水泡或脓泡组织的病毒悬液，接种初生羔羊睾丸细胞观察到明显的细胞病变，免疫荧光试验结果显示，病毒能与山羊痘标准阳性血清反应，在感染的细胞浆内发出特异性的黄绿色荧光。病毒悬液接种乳鼠、小鼠、豚鼠、兔子都未发病，而接种3月龄山羊则出现典型的山羊痘症状和病理变化，接种9～10日龄鸡胚绒毛尿囊膜，未见出现痘斑，连传3代，均无异常变化。通过病理组织学观察可以看到在细胞浆内有大小不一圆形或椭圆形的包涵体，在电子显微镜下可以观察到150nm～300nm大小，卵圆形、砖形，有囊膜的病毒颗粒。利用一对山羊痘病毒P32基因引物进行了PCR扩增，将所得序列与GenBank收录的5株山羊痘病毒P32基因的核苷酸及氨基酸序列比较分析。结果与疫苗株的同源性分别为99．8％和99．4％。与国外其它毒株的同源性为99．6％和98、8％～99．4％。研究结果表明，所分离的病毒为山羊痘病毒，在生物学特性上与资料记载存在一定的差异，P32基因与疫苗毒和国外毒株之间同源性非常高。将该毒株命名为山羊痘病毒LiuJiang／2003株。     

江苏地区2株山羊痘病毒的分离与鉴定

为对江苏部分地区羊场羊痘病毒进行有效的监测和防控,及时了解病毒遗传进化趋势,降低规模化养羊业的风险,本研究从江苏部分地区养羊场采集疑似羊痘病羊的皮肤丘疹、水疱或脓疱组织病料样品,分别接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜、胎羊睾丸细胞(LT)和牛肾细胞(MDBK),观察鸡胚病变和细胞病变情况。同时通过PCR方法扩增羊痘病毒p32基因进行序列分析,并进行p32基因限制性片段长度多态性分析。结果显示,接种鸡胚绒毛尿囊膜形成典型的痘斑,胚体出血;系统进化分析显示,两株分离株属于山羊痘病毒(GTPV);限制性片段长度多态性分析结果也显示符合GTPV的特征。本研究所分离到的2株GTPV,为当地制定山羊痘的防控策略提供依据。     

海北白藏羊羊痘病毒感染的诊断与病毒分离鉴定

青海省门源县麻莲乡瓜拉村某白藏羊个体养殖户部分2~3月龄羊突然发病,发病羊呼吸困难、持续高热、全身皮肤出现痘疹和水疱,经临床和实验室诊断,确诊为羊痘病毒感染。对病原进行分离与鉴定:取病羊的皮肤痘疹和水疱接种绵羊睾丸细胞出现了明显的、规律的细胞病变,该分离毒株的TCID50为105.1/0.1 m L,能被羊痘病毒阳性血清所抑制,其核苷酸序列与Gen Bank上登录的绵羊痘病毒同源性高达99.6%。     

集约化羊场对羊痘的诊治

正羊痘是由羊痘病毒引起的一种人畜共患传染病。病变出现在皮肤无毛或少毛的部位。病初发生红斑、血疹,之后形成水疱、脓疱,最后结痂。本病流行很广,每年各地区时有发生,以春、秋两季流行较多见,可给养羊业造成巨大损失。痘病毒属痘病毒科、山羊痘病毒属,分为绵羊痘病毒和山羊痘病毒,因此羊痘可分为绵羊痘和山羊痘。1病原绵羊痘病原体为绵羊痘病毒。绵羊痘病毒可在易感动物的皮肤、鸡胚的绒毛尿囊膜和易感的组织细胞里进行培养继     

山羊痘病毒反向末端重复序列的克隆与序列分析

应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向末端重复序列片段,将其克隆至pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-ITR,再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组菌进行序列测定,并将所得序列与GenBank收录的2株山羊痘病毒、3株绵羊痘病毒全基因序列进行比较分析。结果:所测4个毒株序列与GenBank上收录的山羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为100%,与绵羊痘病毒该片段核苷酸序列的同源性均为98.3%。研究结果表明,山羊痘病毒反向末端重复序列与已收录的羊痘毒株之间该片段的同源性非常高,为今后兽医临床上应用PCR方法检测羊痘病毒提供了另一更为特异、保守的基因片段。     

山羊痘病毒的分离与鉴定

对贵州省2002年以来发生的疑似山羊痘病例样品进行了病毒的分离与鉴定。取山羊痘病羊的皮肤痘疹和水疱作待检病料,接种BHK-21传代细胞盲传3代后,出现了明显的、规律的细胞病变(CPE),病毒细胞培养物在F4代以后,能与山羊痘标准阳性血清在琼脂扩散试验中出现白色沉淀线,而与正常细胞的培养物及PBS不出现沉淀线;参照GenBank上山羊痘病毒P32基因序列,设计了1对特异性引物,对现场分离毒株进行PCR扩增,可扩增出963bp特异性的DNA条带。用待检病料感染的BHK-21细胞培养物接种9日龄鸡胚绒毛尿囊膜,随着传代次数的增加,痘斑病变的出现率从13.3%～20%上升至33.3%～40%;用山羊痘病变皮肤、鸡胚绒毛尿囊膜和感染细胞进行超薄切片,在电子显微镜下可以观察到典型的山羊痘病毒粒子。     

绵羊痘病毒的分离与鉴定

利用羔羊睾丸细胞、Marc-145、Vero细胞对病毒进行分离和培养,通过动物回归试验、组织病理学切片的观察、透射电镜观察、PCR鉴定等方法进行病毒的鉴定,并参照GenBank中绵羊痘病毒P32基因序列设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的P32基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行同源性比对分析。结果显示:透射电镜下观察到典型的痘病毒粒子;动物回归试验中试验动物临床症状为典型的羊痘症状;组织病理学切片中观察到羊痘病毒嗜酸性包涵体;通过DNASTAR与参考毒株进行同源性比对,与参考株同源性为97.2%~99.5%。结果表明:该分离株为绵羊痘病毒,并命名为SPPV-NeiMengG2015。     

一株绵羊痘病毒的分离鉴定

对黑龙江省齐齐哈尔地区疑似羊痘病毒(CaPV)感染的病例通过临床症状进行初诊后,采集病羊皮肤丘疹、脓疱等病料,接种于牛肾细胞(MBDK),盲传5代,观察细胞病变情况;同时将病料接种于9日龄鸡胚的绒毛尿囊膜,观察鸡胚病变情况;利用PCR方法扩增病毒的P32基因;扩增产物经测序后构建系统进化树。结果:细胞出现规律而明显的细胞病变;鸡胚绒毛尿囊膜观察到特征性痘斑;扩增的P32基因片段长度为972 bp;系统进化树结果显示本研究分离的CaPV与其他绵羊痘病毒(SPPV)聚集在一个分支,证明该病毒为SPPV。     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已经发表的羊传染性脓疱病毒毒株StrainNZ2的VIR基因序列,设计合成1对引物。采用PCR技术对内蒙古分离株（OV/nm-05）的VIR基因进行特异性扩增,然后将其克隆到pEASY-T1载体中进行测序,得到该病毒的VIR基因序列。序列分析表明,OV/nm-05株与1710/03株的同源性最高,达98.0%;与513/04株的同源性最低,为95.4%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因与其他参考毒株之间差异不大,这为进一步从分子生物学角度了解VIR基因的结构和功能奠定了基础。     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。     

Isolation and Identification of a Field Strain of Marek's Disease Virus and Analysis of Major Pathogenic Genes

In a certain area of Shandong province, Marek's disease (MD) occurred in diseased chickens that had been vaccinated by turkey herpesvirus.In order to isolate the virus strain and detect the virus pathogenicity, agar diffusion test, cell culture and indirect immunofluorescence assay (IFA) were used to isolate the Marek's virus from chicken's blood and feather marrow.The isolated strain was adapted to grow in chick embryo fibroblasts (CEF).Genes involved in pathogenesis of MDV, such as meq, pp38 and 132 bp repeat sequence were amplified by PCR.The obtained sequences were compared with that of standard strains published in GenBank by DNAStar software.The results showed that pp38 gene of the SDAU-1 shared homology from 100% with standard virulent sequence.Analysis of 132 bp repeat sequence and meq gene sequences of the viral genome showed that the isolated virus belongs to the highly virulent MDV strains.     

鸡传染性支气管炎病毒SH株的分离及鉴定

从黑龙江省绥化市某养鸡场疑似鸡传染性支气管炎的鸡群中采集病料,经鸡胚传代、电镜观察、生物学特性和分子生物学鉴定以及动物回归试验,表明该分离株具有明显的鸡传染性支气管炎病毒特征,具有鸡胚出现卷曲、出血、发育延迟等作用;对新城疫病毒有明显的干扰作用;动物回归试验导致未免疫鸡出现明显的感染症状,剖检可见明显的肾脏肿胀、尿酸盐沉积现象,同时可见呼吸道有出血现象。对该毒株的N基因进行扩增,并将其序列与NCBI的参考毒株的N基因进行序列对比,发现其与国内的分离株SC和N毒株的N基因具有较高的同源性,为97.6%;与国外参考毒株和国内的疫苗株同源性较低,为84.8%。表明分离的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。     

羊痘病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因序列分析及其在鉴别病毒种属上的作用

为明确G蛋白偶联趋化因子受体(GpCR)基因在羊痘病毒种属鉴别中的作用,本实验对3株绵羊痘病毒(SPV)和2株山羊痘病毒(GPV)弱毒疫苗株的GpCR进行了克隆测序,并与GenBank中登录的21个羊痘病毒属成员相关序列进行了比对。核酸同源性分析表明SPV不同毒株之间同源性达到99.5%～99.8%;GPV之间同源性达到98.8%～99.8%;GenBank上公布的疙瘩皮肤病病毒(LSDV)之间同源性达到100%。而GPV、SPV和皮肤疙瘩病毒两两比对的同源性仅达到94.2%～95.9%。对GpCR的系统进化树分析可以看出GPV、SPV和LSDV分别位于不同的进化分枝上,而GPV与LSDV具有更近的亲缘关系。GpCR基因在鉴别GPV属和流行病学分析中具有重要价值。     

鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析

为调查辽宁地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及遗传演化情况,从辽宁某鸡场疑似鸡传染性支气管炎病料中分离得到1株病毒,经分子生物学检测、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒血凝特性干扰试验和动物回归试验,确定该毒株为IBV,并命名为CH/LN/2019。扩增该毒株S1基因并进行序列分析发现,分离株S1基因全长1 620 nt,编码540个氨基酸,S1蛋白裂解位点为HRRRR,属于基因Ⅰ型(QX型)毒株;同源性比对发现,分离株与基因Ⅰ型代表毒株QXIBV株的核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为95.6%和94.8%;与国内常规型疫苗H52、H120和Ma5毒株的同源性较低,核苷酸和氨基酸序列同源性仅为77.2%~76.9%和75.4%~76.2%。本试验为辽宁地区鸡传染性支气管炎的流行病学调查及免疫防控提供了参考。     

鸡传染性支气管炎病毒CQ/01/2004株的分离与鉴定

2004年从重庆某肉用鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集病料，按常规处理后接种9～10日龄鸡胚，通过鸡胚连续传代培养3代，并对该分离毒株的鸡胚致病性、血凝性和NDV的干扰特性进行检测．同时进行了动物回归试验。结果表明，该分离株具有IBV感染特征，可使鸡胚胚体出血、蜷缩、矮化；该分离毒株无直接血凝性，对NDV有明显的干扰作用；动物回归试验中有75％的感染鸡在10d内发病或死亡。剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀，肾小管内充塞大量尿酸盐，支气管有出血点、有大量粘液。采用反转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对CQ／01／2004的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定，结果表明该基因具有IBVSl基因的共有分子特征，将测序结果提交GenBank进行同源性检索，发现分离株CQ／01／2004和J株S1的同源性最高，核苷酸同源性为94％，氨基酸同源性为89．4％，与M41的核苷酸同源性为80．6％，氨基酸同源性为78．0％。试验结果表明，分离的病毒株CQ／01／2004为鸡传染性支气管炎病毒。     

Comparative sequence analysis of 16S rRNA gene of Pasteurella multocida serogroup B isolates from different animal species

The phylogenetic relationships of five isolates of Pasteurella multocida serotype B:2 belonging to buffalo, cattle, pig, sheep and goat were investigated by comparative sequence analysis of 16S rRNA gene. The 1468bp fragment of 16S rRNA gene sequence comparison showed that the isolates of cattle (PM75), pig (PM49) and sheep (PM82) shared 99.9% homology with the buffalo isolate (vaccine strain P52) whereas, the goat isolate (PM86) shared 99.8% homology with the vaccine strain. The 16S rRNA gene sequences of these isolates were also found monophyletic with type B reference strain NCTC 10323 of P. multocida subsp. multocida. The present study indicated the close relationships of haemorrhagic septicaemia causing P. multocida serotype B:2 isolates of buffalo and cattle with other uncommon hosts (pig, sheep and goat).