家蚕BmNPV多角体蛋白与大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的融合表达

L-天冬酰胺酶是一种重要的蛋白类抗肿瘤药物,可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成,导致肿瘤细胞的死亡.通过基因融合的方法,将大肠杆菌的asp基因在家蚕杆状病毒中表达,其活性进一步提高到5 940U/mg,为利用家蚕生物反应器生产该蛋白打下了基础.     

利用家蚕杆状病毒da26基因融合表达L-天冬酰胺酶成熟肽

L-天冬酰胺酶是一种有效的抗肿瘤药物,通过利用杆状病毒表达系统表达L-天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)与da26的融合蛋白,利用家蚕生物反应器大量生产该蛋白,为L-天冬酰胺酶在临床上的广泛应用打下基础。     

家蚕杆状病毒侵染机制研究获得新进展

正家蚕是一种鳞翅目的模式昆虫,与杆状病毒相互作用的研究具有多方面的应用价值。家蚕和杆状病毒相互作用机制的阐明对害虫的生物控制,外源蛋白的真核表达和宿主免疫抗性等方面都有十分重要的意义。西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室以杆状病毒和家蚕为模型,揭示病毒在侵染过程中与宿主的相互作用。该项研究是实验室继抗病毒育种研究之后,在病毒感染机制研究取得的又一重要成果。实验室通过分析杆状病毒易感品系和正常大造品系发现家蚕spry基因在易感品系中低表达。     

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

利用双色荧光观察分析重组家蚕杆状病毒对昆虫细胞及蚕体组织的感染

尝试将红色荧光蛋白(RFP)作为昆虫表达体系的分子标签,克隆了rfp基因的读码框,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将该基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)中,获得重组杆状病毒BmNPV-rfp。对家蚕细胞的感染表明,rfp适于在昆虫细胞中表达,在显微镜下红色荧光很明显,说明RFP可以作为杆状病毒表达的分子标签。BmNPV-rfp和另一种插入绿色荧光蛋白基因gfp的家蚕重组杆状病毒BmNPV-gfp混合感染家蚕细胞和幼虫的实验表明,二者的荧光很少在同一细胞中发生重叠,说明昆虫细胞大多只感受1次同一来源的病毒。BmNPV-rfp、BmN-PV-gfp与AcNPV混合感染Sf21细胞的结果也证明了该推断,并且还显示AcNPV可以协助BmNPV来源的病毒基因在Sf21细胞中表达以及协助病毒增殖或产生杂交病毒,但尚未明确其机制。     

Bac-to-Bac系统的研究进展及在家蚕中的应用

Bac-to-Bac策略是目前昆虫杆状病毒表达系统获取重组杆状病毒最为方便、快捷的途径之一。以Bac-to-Bac系统面向的苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcMNPV)表达系统、家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统、棉铃虫杆状病毒(HaNPV)表达系统等3个主要子系统为对象,从宿主域逐渐扩大、蛋白的表达水平不断提高、筛选和纯化更为简便高效以及在家蚕中应用的状况等角度,对Bac-to-Bac系统的发展及功能、特点等进行了阐述。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物.结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在...     

家蚕Polh+ Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的构建

为利用杆状病毒的强启动子——多角体启动子而构建的重组杆状病毒一般是多角体缺失型(polh-)病毒。为了解决家蚕生物反应器规模化生产中病毒必需经皮接种而效率低下的问题,在建立家蚕Bac-to-Bac快速表达系统的基础上,构建了能形成多角体的家蚕Polh+ Bac-to-Bac表达系统。通过该系统能够产生表达外源目的基因的重组病毒,获得的该重组病毒能在培养细胞内表达,也能通过经口添食感染表达。利用EGFP报告基因分析了该系统的表达效果,构建的重组病毒不仅有效表达了EGFP蛋白,还在细胞核中形成了大量多角体。该系统较好解决了重组病毒必需经皮接种感染的缺陷,提高了生产效率,拓宽了杆状病毒在生物杀虫剂、基因治疗等领域的应用前景。     

杆状病毒GP64表面展示元件与L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表达的初步试验

GP64是Ⅰ型杆状病毒的主要囊膜糖蛋白,利用基因重组技术在gp64中插入外源蛋白基因,二者在病毒表面融合表达活性肽或蛋白质,可以免去纯化表达产物的繁琐。L-天冬酰胺酶Ⅱ(ASP)是一种临床上广泛使用的蛋白类抗肿瘤药物,利用家蚕杆状病毒(BmNPV)GP64展示系统表面展示ASP,探讨以表面展示有ASP蛋白的出芽型病毒粒子(BV)生产抗肿瘤药物的可行性。构建重组转移载体pFast Bacdual-gp64sp-asp-gp64ctd,并转化E.coli DH10BacTM,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒DNA,将重组杆粒DNA通过脂质体转染至Bm N细胞,获得了重组病毒。重组病毒大量感染Bm N细胞后72 h,收集感染病毒的细胞培养液超速离心纯化BV。采用奈氏试剂法检测接种重组病毒的Bm N细胞内表达融合ASP的酶活力为1 788.4U/mg;Western blot检测纯化后的BV中含融合ASP蛋白,然而BV中的ASP检测不出酶活性。试验结果提示,构建的杆状病毒GP64展示系统可以将ASP转到BV上,但产物的活性保持有待进一步研究。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

利用家蚕-HyNPV表达系统表达鼠抗人CD28分子单链抗体

人CD28分子是T细胞表面的最重要的协同刺激分子。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28-ScFv)亚克隆至杂交病毒HyNPV Bac-to-Bac系统供体质粒pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFast-BacHTa CD28-ScFv,并转化大肠杆菌(E.coli)DH10Bac获得重组杆粒rBacmid CD28-ScFv,脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV CD28-ScFv。该重组杆状病毒注射接种于家蚕5龄起蚕,经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,CD28-ScFv在家蚕体内得到了表达,即:人CD28单链抗体通过HyNPV这一宿主范围扩大的新型杂交杆状病毒表达载体在家蚕中获得了表达。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素

牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素(BoIFN-α)及牛λ1干扰素(BoIFN-λ1)。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数(CAI)值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV*GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

以蚕蛹生产生物活性物质的操作方法

近年来,随着基因工程和重组技术的发展,家蚕作为生物反应器(家蚕杆状病毒表达载体系统)生产重组生物活性物质的优良特性被生物学家所认识,许多重组生物活性物质通过家蚕这一优良生物反应器得到表达和生产。如中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点实验室用家蚕高效表达了植酸酶基因.用于饲料添加剂,可大幅度减少饲料中无机磷的添加量.提高了料肉比,并减少了磷对环境的排放。又如浙江大学生物化学研究所用家蚕高效表达hGM-CFS制备口服药具有显著的升白细胞功能。     

猪α+γ共表达干扰素在不同家蚕品种中的表达

本实验拟探索猪α+γ复合型干扰素(IFN-α+γ)共表达重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ)在不同家蚕品种中的表达效率,以期筛选出较适合共表达猪IFN-α+γ的家蚕品种。实验分别对24个原种和7对杂交种共38个家蚕品种的蚕蛹接种重组杆状病毒r Bm NPV(Bm-α+γ),然后利用ELISA方法对猪IFN-α进行表达量检测和比较。结果显示不同家蚕品种对猪α干扰素的表达不同,日系原种的表达量要高于中系原种,且日系×中系杂交种组合普遍高于中系×日系杂交组合。     

JAK/STAT途径对家蚕杆状病毒感染应答的初探

为了探讨家蚕抗病毒感染的免疫应答途径,通过非转座子介导将家蚕信号转导子及转录激活因子(STAT)基因表达盒(BmSTAT)导入家蚕卵巢培养细胞(BmN),经吉欧霉素(zeocin)筛选获得过表达BmSTAT的稳定转化BmN细胞。修饰型线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6感染结果显示:病毒感染后转化BmN细胞和正常BmN细胞的BmSTAT基因表达水平分别提高了32.70%和14.63%,表明家蚕JAK/STAT途径对杆状病毒感染有应答。比较转化BmN细胞和正常BmN细胞对杆状病毒感染的抵抗性,发现病毒对转化BmN细胞的感染比例低于正常BmN细胞,二者之间的感染率相差8.28～18.02个百分点;在感染病毒的转化BmN细胞中,β-半乳糖苷酶基因的表达水平比病毒感染正常BmN细胞的略低,推测这与转化BmN细胞中的BmSTAT水平(JAK/STAT途径信号)高于正常BmN细胞有关。然而,在BmN细胞中,BmSTAT基因的过表达尚不足以明显提高细胞对病毒感染的抵抗力。研究结果为进一步探讨家蚕JAK/STAT途径在病毒感染应答方面的作用奠定了基础。