猪瘟DNA疫苗的临床免疫实验

在前期研究工作筛选出2种DNA疫苗质粒的基础上,采用3种免疫策略(DNA疫苗单独免疫法、DNA疫苗初免蛋白免疫加强的prime-boost方法以及沙门氏菌(Salmonella)载体介导法),于某规模化猪场对猪瘟病毒(CSFV)的DNA免疫效果进行了临床应用研究。随机选择未经猪瘟疫苗免疫的断奶仔猪60头,分6组进行免疫接种,检测免疫猪抗体产生情况并对各组免疫猪进行攻毒试验。免疫猪血清抗体ELISA检测结果表明,pcDSW组、pIRE2IL2组、pcDSW E2protein组和pIRE2IL2 E2protein组均产生了较高的抗体水平,而沙门氏菌介导的2种DNA疫苗质粒诱导的抗体水平不显著。攻毒试验结果表明,pcDSW和pIRE2IL2单独免疫组或prime-boost组能够抵抗致死剂量的CSFV石门强毒攻击,保护率87.50%￣90.00%。其中pcDSW效果好于pIRE2IL2。而沙门氏菌介导的DNA疫苗组不能产生有效保护。不同接种途径的免疫效果比较结果表明,颈部肌肉注射免疫后产生的抗体水平较后肢胫前肌注射免疫产生的抗体水平高。     

流感复合多表位疫苗的设计及小鼠免疫研究

鉴于目前出现了多种亚型禽流感病毒共存的局面,研究多价流感疫苗具有重要意义。根据各表位的免疫学特性,结合分子生物学信息软件的模拟功能,以H 3、H 9亚型流感病毒的HA抗原表位、流感病毒的其他主要抗原(NP、NA、M)表位的基因为基础,再附以K ozak序列和适当的酶切位点,设计并合成大小为765 bp的复合多表位基因盒-Ep。i将Ep i基因克隆入真核表达载体pIRES1neo中,构建DNA重组体pIR-Ep i;将H 7HA、Ep、iH 5HA基因以融合表达方式克隆到pIRES1neo中,构建了DNA重组体pIRE-H 57-Ep。i以上述构建的DNA重组体与鸡痘病毒重组株对BALB/c小鼠进行免疫接种后,检测体液与细胞免疫指标。研究结果表明,流感病毒复合多表位DNA重组体pIRE-H 57-Ep、ipIRE-Ep i免疫组小鼠均能产生针对H 3亚型流感病毒的特异性抗体,抗体效价(1∶1 600~1∶6 400)低于灭活疫苗免疫组(1∶12 800),但均高于其他对照免疫组(P<0.01)。pIRE-H 57-Ep i免疫组抗H 5、H 7 HA抗体效价分别为1∶12 800和1∶6 400,均高于其他免疫组(P<0.05)。pIRE-Ep i免疫组抗H 5、H 7HA抗体效价(1∶200,1∶100)较低,与其他对照免疫组差异不显著。pIRE-H 57-Ep i与pIRE-Ep i免疫组抗H 9亚型A IV的HA抗体效价(1∶6 400,1∶3 200)明显高于其他免疫组(P<0.05)。与PBS对照组及空质粒pIRES1neo对照组比较,用所构建的重组体免疫的各试验组小鼠的T淋巴细胞亚类CD 4 和CD 8 的数量显著提高(P<0.05)。pIRE-H 57-Ep i与pIRE-Ep i试验组的CD 4 与CD 8 淋巴细胞的数量较灭活苗显著增多(P<0.05),而各重组体免疫组之间差异不显著。此外,所有组的CD 4 /CD 8 比值均稳定在1.5~2.0,表明无异常免疫应答出现。EL ISPOT检测小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ-斑点数实验结果表明,pIRE-H 57-Ep、ipIRE-Ep i试验组的IFNγ-斑点数量(>70)比灭活苗(<40)显著增多(P<0.05),而各重组体免疫组之间差异不显著。上述结果说明,所构建的DNA重组体有良好的免疫原性,为最终获得能同时预防多种亚型流感病毒的多价疫苗奠定了基础。     

流感病毒血凝素茎干部通用疫苗的构建及免疫原性研究

为了构建基于血凝素(hemagglutinin,HA)茎干部的流感通用疫苗并研究其免疫原性,本研究以A/Puerto Rico/8/1934(H 1Nl)流感病毒为模板,扩增HA茎干部区域主要蛋白HA2(HA的344～566 aa)和完整茎干部HA-stem(缺失53 aa～276 aa的HA),与真核表达载体pCAGGS连接获得重组质粒.将重组质粒瞬时转染至HEK-293T细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光实验检测其表达情况.将6～8周龄健康雌性BALB/c小鼠(Mus musculus)分为4组,即2个重组质粒组及pCAGGS质粒对照组和磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)对照组,分别于0和30 d免疫2次,在免疫当天(第0天)及免疫后第60天采集小鼠眼眶血,测定其HI抗体、细胞中和抗体和IFN-γ水平.结果表明,成功构建了重组质粒pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem,且重组质粒转染HEK-293T细胞后均能检测到目的蛋白及其mRNA.免疫后第60天pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem免疫组对A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)病毒的HI抗体效价均为5 log2,中和抗体效价分别为1∶27和1∶24.对异源病毒A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)病毒的HI抗体效价分别为3 log2和6 log2,中和抗体效价分别为1∶24和1∶22.pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem组1NF-γ含量分别为(2362.40+98.24) ng/L和(2497.06+ 120.44) ng/L.pCAGGS-HA2及pCAGGS-HA-stem诱导产生的抗体及INF-γ水平与免疫前及对照组相比差异显著(P＜0.05).结果表明,pCAGGS-HA2和pCAGGS-HA-stem能够诱导对异源病毒的交叉反应,有望作为候选的流感通用疫苗.     

运送鹅源新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,约1700bp,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,得到候选DNA疫苗pVAX1-F0将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)X4550,获得运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550(pVAX1-F).以2×108CFU/只的剂量两次免疫CD1小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体应答,X4550(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于X4550(pVAX1)组(P＜0.05),表明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并能够刺激机体产生免疫应答.     

HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响，pCIHA5、pCAGGHA5 、pCIoptiHA5和 pCAGGoptiHA5分别以100 和10 μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后分别用100 LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV) A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化，对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明，100 μg剂量组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 均可对免疫鸡形成100％完全保护（不发病、不致死和不排毒），pCIoptHA5(75%) 和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护；10 μg剂量免疫组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 可对免疫鸡形成100％的保护（不发病和不致死），pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%)，而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明，HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果同时证明，通过密码子和载体的优化，可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10 μg，其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗，有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。     

C3d对减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答的增强作用

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F扩增出新城疫病毒F48E8株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入含有3 拷贝C3d 编码基因的pTR-C3d3质粒中,获得重组质粒pTR-F-C3d3。将F-C3d3基因片段从pTR-F-C3d3中切出,克隆入真核表达质粒pVAX1中,获得重组真核表达质粒pVAX1-F-C3d3。将pVAX1-F-C3d3转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F-C3d3)。重组菌分别以1×109 CFU的剂量两次口服免疫1日龄SPF鸡,结果显示,SL7207(pVAX1-F-C3d3)激发产生的血清抗体效价与SL7207 (pVAX1-F)免疫组之间存在显著性差异(P < 0.05)。SL7207(pVAX1-F-C3d3)免疫组的小肠黏膜抗体效价高于SL7207(pVAX1-F)免疫组,但两者间差异不显著(P > 0.05)。提示C3d可增强减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答水平,这为提高基于减毒沙门氏菌的NDV基因工程疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

不同剂量CpG-ODN佐剂与ALV-Jgp85重组蛋白联合免疫诱导种母鸡血清抗体和母源抗体的比较

为比较不同剂量非甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)免疫佐剂与J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian leukosis virus,ALV-J)gp85重组蛋白联合免疫后诱导母鸡血清抗体和母源抗体的效果,利用原核表达系统制备包含gp85基因的重组蛋白作为免疫原,与不同剂量CpG免疫佐剂联合接种成年海兰褐父母代种母鸡(Gallus domesticus),首免后2周加强免疫一次,于接种前和接种后每周动态检测血清抗体,接种后部分鸡只每周收集种蛋,检测卵黄抗体。结果显示,利用原核表达系统制备的gp85重组蛋白能与ALV-J单克隆抗体JE9特异性结合;与3个不同剂量CpG联合免疫成年种母鸡后均诱导鸡只产生一定效价的血清抗体,首免后28 d效价最高;所诱导的卵黄抗体效价首免后第4周最高。其中以50μg/羽剂量的CpG联合重组蛋白接种鸡只诱导的血清抗体和卵黄抗体效价和阳性比例最佳,100μg/羽剂量的CpG次之。3个不同剂量的CpG与ALV-J gp85重组蛋白联合免疫均能诱导母鸡产生一定的血清抗体和卵黄抗体,50μg/羽剂量的CpG联合免疫的效果明显优于较高剂量的免疫效果。本研究为使用CpG联合ALV-J gp85重组蛋白诱导母鸡产生母源抗体,阻断ALV-J早期感染提供科学依据。     

以鸡恒定链(Ii)为载体的新城疫病毒-F蛋白表位基因疫苗的免疫原性

本文研究了以鸡恒定链基因(invariant chain,Ii)为载体的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因片段的基因疫苗及其小鼠的免疫应答.首先,用重叠延伸法经3轮PCR获得以NDV-F343表位基因(327-359 AA)取代鸡恒定链中Ⅱ类分子相关肽段(class-Ⅱassociated invariant chain peptide,CLIP)片段序列,构建了基于恒定链的NDV内源性靶向基因疫苗(C1-△CLIP-Ii-F343).其次,在观察C1-△CLIP-Ii-F343和无恒定链载体的C1-F343转染真核细胞中,发现它们均能在COS-7细胞中高效表达.最后,将25只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠(Mus musculus)随机分为5组,用C1-△CLIP-Ii-F343和非靶向性疫苗(C1-F343)进行免疫,以C1-△CLIP-Ii、pEGFP-C1和生理盐水作为对照.经3次免疫后,取小鼠尾部血对小鼠的体液免疫进行检测.结果表明,在C1-△CLIP-Ii-F343和C1-F343免疫组小鼠血清中均可检测到针对NDV的特异性抗体,其滴度分别达到1/6400和1/1600.进一步Western blot研究结果表明,抗体与接种NDV的鸡胚尿囊液和原核表达的PET-NDV-F306蛋白均产生特异性结合.研究结果提示,鸡恒定链作为载体的NDV基因疫苗能够刺激小鼠产生特异性的体液免疫应答,为新城疫疫苗开发提供了一个新的思路.     

生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫*

为构建高免疫原性的生长抑素（somatostatin，SS）DNA疫苗，将SS基因插入到pcS／SS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间，构建含2拷贝SS的融合表达质粒pcS／2SS。酶切和测序鉴定表明，重组质粒pcS／2SS构建成功。脂质体包裹法将pcS／2SS转染HeLa细胞，ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。结果表明，融合目的基因在HeLa细胞获得表达，S／2SS融合蛋白具有比S／SS融合蛋白更强的SS抗原抗体反应性。将pcS／2SS免疫6只大鼠后，2／3的大鼠产生了抗SS抗体，结果证明，所构建的质粒pcS／2SS可以表达生长抑素，表达产物具有免疫原性。     

普通质粒载体与Semliki森林病毒复制子载体表达GHRH的比较

新一代Semliki森林病毒RNA复制子源自甲病毒属Semliki森林病毒的基因组,它克服了一些现有的DNA和RNA载体表达效率低的缺点。复制子保留了编码病毒复制酶的基因,结构基因被外源基因所取代。复制酶能够使RNA在胞质中高水平的复制以及外源基因高水平的表达。为了评价SFV复制子载体提高外源基因表达的效力,本研究首先对pIRES-neo表达载体用BamHⅠ酶切和去磷酸化,连接LacZ基因,构建了普通真核表达载体pIRES-neo-LacZ。然后采用脂质体介导分别将含报道基因LacZ复制子载体pCMV-rep-LacZ和两个普通表达载体pLNCX-LacZ、pIRES-neo-LacZ转染293细胞;将表达GHRH的复制子载体pCMV-Rep-GHRH和普通载体pIRES-GHRH、pCDNA3-GHRH转染293细胞。分别对不同载体转染细胞表达的β-半乳糖苷酶以及利用RIA 、RT-PCR对表达的GHRH进行了定量分析,结果表明：复制子载体表达外源基因的效率比非复制子载体高2～3倍。本研究为提高外源基因在真核细胞的表达提供了有益的探索。     

检测兽用疫苗中支原体污染的PCR-ELISA技术的建立及应用

建立了检测兽用疫苗中支原体污染的PCR-ELISA方法,探索其最佳实验条件及优化组合。实验依据GenBank中登录的鸡源支原体和猪源支原体16SrRNA基因序列(登录号:Mg,AY744942;Mhp,AE017244;Mhs,AY973563;Mf,X63377),运用DNAStar软件和Primer5.0软件设计PCR特异性引物和探针,其中引物用地高辛标记,探针用生物素标记。以培养的支原体中提取的DNA为模板,依据PCR-ELISA技术原理设计实验,建立并优化PCR-ELISA反应条件。对30批鸡新城疫Ⅰ系活疫苗、30批鸡新城疫La Sota系活疫苗样品和30批猪瘟活疫苗样品进行检测。结果表明,应用建立的PCR-ELISA反应体系和条件可以从疫苗样品中检测到支原体,检测率为35.6%,比PCR法的检测率高11.2%。该方法灵敏度高,特异性强,在疫苗的支原体污染检测中具有推广应用价值。     

Construction of Canine parvovirus DNA Vaccine and Detection of Its Inoculated Mice

用PCR方法扩增犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV) 貉分离株(PV/貉/CC/1/86)的VP2蛋白基因，并将其克隆入pMD18-T，命名为pTCPV，进行测序分析。结果除发现300G→S突变外，还发现32G→D突变。然后将PV/貉/CC/1/86 VP2蛋白基因克隆入真核表达载体pVAX1的CMV启动子的下游，构建了CPV核酸疫苗的真核表达质粒pVCPV。pVCPV转染BHK-21细胞能够表达CPV VP2蛋白，所表达的CPV VP2蛋白能够与抗CPV的阳性抗体发生特异性的抗原-抗体反应。用pVCPV免疫接种小鼠，用ELISA和微量中和试验检测免疫小鼠抗CPV抗体阳性，但是没有检测到抗CPV HI抗体； pVCPV免疫小鼠的脾淋巴细胞对特异性和非特异性抗原刺激均有明显的增殖。结果表明, pVCPV免疫接种小鼠能够诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫和细胞免疫。     

Antioxidant and chemopreventive properties of polyphenolic compounds derived from Greek legume plant extracts

Recently, phytochemical compounds present in legumes have gained a lot of interest because they are considered to be possible chemopreventive agents. In the present study, 14 polyphenolic compounds were extracted and identified from two unique varieties of Leguminosae family plants cultivated in Greece and screened for their antioxidant and chemopreventive properties. Ten polyphenolic fractions, which are mainly mixtures of two compounds and five pure flavonoids, were isolated from the methanolic extracts of aerial plant parts of Vicia faba and Lotus edulis (Leguminosae), respectively. All of these fractions exhibited significant DPPH(*) radical scavenging capacity. Furthermore, they exerted significant protective activity against free radical-induced DNA damage. This activity was more potent against ROO(*) radical-induced DNA damage than against that induced by OH(*) radicals. Finally, they exhibited significant ability to inhibit the activity of the topoisomerase I enzyme. These results imply that the polyphenolic compounds identified in the fractions were responsible of the observed properties of the fractions and the initial extracts and indicate different mechanisms by which these phenolic compounds may act as chemopreventive agents.     

萝卜胞质雄性不育正常花蕾与败育花蕾DD-PCR及EST序列分析

提取了萝卜雄性不育系BT-18败育花蕾和正常花蕾的DNA,并且采用DD-PCR技术研究了败育花蕾与正常花蕾的mRNA差异表达。败育花蕾DNA表现有规则的Ladder,而正常花蕾只有单一DNA条带,该结果为萝卜败蕾发生了细胞程序化死亡提供了生化证据;DD-PCR得到107个差异表达片段,其中败育花蕾差异表达片段94个,正常花蕾差异表达片段13个。BLAST结果显示,与功能蛋白同源的差异序列50%以上来源于叶绿体,推测萝卜败蕾与叶绿体有很大关系;叶绿体Mat K在不同的引物组合扩增中出现3次,序列分析后发现长度为282bp和283bp的为同一片段,长度为396bp的片段与长度为282bp和283bp的片段无同源性,可能为编码Mat K的不同亚基。Mat K参与叶绿体中RNA转录本Ⅱ型内含子剪切,通过对内含子剪接的影响来调节基因的表达,推测Mat K等叶绿体基因上调表达使其蛋白质的合成发生变化,导致萝卜叶绿体代谢紊乱,最终导致败蕾;而甲基转移酶可能通过DNA甲基化调控萝卜发育,使其发育异常表现花蕾败育。对BLASTx比对分值小于80及无同源性的片段进行BLASTn分析,根据比对结果推测:细胞程序化死亡可能是萝卜败蕾、植物衰老和植物受逆境胁迫时普遍发生的一种生理生化现象。     

Untersuchungen über den Einfluß des Kinetins und des Eisens auf den Nukleinsäure- und Proteinstoffwechsel von Karottengewebekulturen

The Influence of Kinetin and Iron on Nucleic Acid and Protein Metabolism of Carrot Tissue Cultures Carrot-root tissues cultured in a nutrient solution containing Kinetin had a high rate of cell division, that led to an undifferentiated callus, and a relatively low DNA content per cell. The same tissues growing without Kinetin had a smaller rate of cell division and a higher DNA content, and showed the ability to form roots. By addition of ³²P to the nutrient solution, the cultures growing with Kinetin showed a higher specific activity of DNA than those growing without Kinetin. From previous experiments and results of other workers the possibility of the occurence of a metabolic labile DNA fraction in the cultures which grew without Kinetin is discussed. A comparison between the influence of iron and Kinetin on cell division activity, root formation, DNA, RNA and amino acid content of the tissue cultures was made on a cell basis. Iron deficiency or absence of Kinetin in the nutrient solution reduced the cell division activity of carrot tissue cultures and increased the content of DNA, RNA and soluble amino acids. The protein content was reduced by iron deficiency but was increased by the absence of Kinetin. Cultures, growing without Kinetin were able to form roots, while those, growing in an iron deficient medium were unable to show the latter phenomenon.     

~(60)Coγ射线辐照蜜环菌的生物学效应

本文研究了6 0 Coγ射线辐照对蜜环菌的生物学效应。结果发现 :1 0～ 80Gy低剂量辐照能提高蜜环菌的生活力 ,促进其生长 ,提高可溶性蛋白质含量 ,对细胞膜脂过氧化无明显影响 ,2 0Gy辐照效果最显著 ,菌丝体生长量较对照增重 3 1 2 0 % ,MDA含量较对照低 2 7 4% ;大于 80Gy辐照则随剂量增大生长受抑制 ,膜脂质过氧化程度加剧。1 0～ 80Gy辐照还提高了菌丝体中SOD活性 ,高于 80Gy则随剂量增加酶活性降低 ;POD活性随辐照剂量递增酶活性提高 ,与MDA含量呈正相关。6 0 Coγ射线辐照提高了蜜环菌中核酸含量 ,且随剂量增加而增加 ,较对照分别提高 3 1 %～ 2 84 3 %和2 40 %～ 1 61 41 %。 2 0Gy剂量辐照使DNA、RNA和可溶性蛋白质含量均提高 ,3者呈明显正相关 ;2 0 0Gy辐照使DNA、RNA含量提高而可溶性蛋白质含量却呈下降趋势 ,其相关系数分别为 -0 83 89和 -0 73 40。琼脂糖凝胶电泳表明 ,2 0Gy辐照对DNA链无明显影响 ,而 2 0 0Gy辐照则出现严重拖尾 ,表明DNA链有严重断裂。DNA断裂主要发生在辐照后 6h之内 ,以后能自动修复     

检测兽用疫苗中霉形体污染的PCR-ELISA技术的建立及应用

本试验建立检测兽用疫苗中霉形体污染的PCR-ELISA方法，探索其最佳试验条件及优化组合，并与PCR检测法作对比，评价其应用价值。试验依据Genbank中登录的鸡源霉形体和猪源霉形体16s rRNA基因序列，运用DNAStar软件和Primer 5.0软件设计PCR特异性引物和探针，其中引物用地高辛标记，探针用生物素标记。然后以培养的霉形体中提取的DNA为模板，依据PCR-ELISA技术原理设计试验，建立并优化PCR-ELISA反应条件。最后用建立的PCR-ELISA扩增体系和条件对从市场上随机购买的30批鸡新城疫Ⅰ系活疫苗样品、30批鸡新城疫La Sota系活疫苗样品和30批猪瘟活疫苗样品进行检测。检测结果表明：应用建立的PCR-ELISA反应体系和条件可以从疫苗样品中检测到霉形体，检测率为35.6%，比PCR法的检测率高11.2%。该方法灵敏度高，特异性强，在疫苗的霉形体污染检测中具有推广应用价值。