大豆GmWRI1a基因启动子克隆及序列分析

以大豆基因组文库Phytozome公布的大豆Williams82基因组序列为参考,应用Primer Premier 5.0软件设计引物,用PCR技术扩增了大豆GmWRI1a基因的启动子序列,构建了重组克隆载体pGM-TpGmWRI1a,并通过PCR扩增对阳性克隆进行鉴定送测序。克隆获得GmWRI1a基因启动子序列1 686bp,该启动子序列除含有必需的起始转录位点、TATA-box、CTTA-box外还包含多个顺式作用元件,如光应答元件、赤霉素应答元件、表达分生组织相关元件、抗旱诱导元件等。同时,构建了该启动子植物表达载体pBI-pGmWRI1a,通过PCR扩增、限制性酶切对阳性克隆进行了鉴定,为启动子的功能研究奠定基础。大豆GmWRI1a基因启动子克隆与序列分析,将为进一步研究大豆GmWRI1a基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

荔枝GRX基因启动子的克隆与瞬时表达分析

为了研究荔枝GRX基因的调控机理,本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 996 bp的启动子片段并对其功能进行了初步分析,结果表明:荔枝GRX基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats、TGA-element等各种转录调控相关的顺式作用元件。基因枪表达分析表明,该启动子能驱动GUS基因在荔枝的花、叶、根、果皮以及果核中表达而在果肉中不表达,具有组织特异性。为进一步研究荔枝GRX基因的表达模式和调控机理提供了基础与依据。     

水稻OsAAA1基因启动子的分离与克隆

水稻稻瘟病抗性新基因OsAAA1是一种诱导型的广谱抗病基因,但OsAAA1的表达模式及调控机理未知。为了研究OsAAA1的表达模式及调控机理,通过对OsAAA1启动子序列的生物信息学分析,克隆了3个OsAAA1启动子区域的缺失体,将上述缺失体转入植物双元表达载体DX2181G中。通过菌落PCR、质粒PCR检测和质粒DNA酶切鉴定并测序确认,结果表明以上3个启动子系列缺失载体构建成功。为进一步研究OsAAA1启动子的表达模式及该基因的调控机理提供了参考依据。     

梭梭HaNAC2基因克隆、表达分析及亚细胞定位

本研究从梭梭中克隆得到1个NAC转录因子,命名为HaNAC2。同源性比对分析结果显示该基因含有典型的NAC蛋白结构域。系统发育分析结果推测该蛋白属于NAC家族第Ⅰ组的SENU5亚家族,组织特异性分析结果表明该基因在梭梭同化枝中表达量最高,荧光定量PCR结果显示该基因的表达量随干旱胁迫时间的增加而升高,推测其表达受干旱胁迫诱导。本研究克隆了该基因的启动子并进行分析,结果发现HaNAC2基因的启动子含有启动子固有元件,如TATA-box,CAAT-box等,还含有一些调控元件如MYB结合位点、组织特异性表达响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列。通过PEG介导的原生质体转化法进行亚细胞定位分析,结果显示该蛋白定位于细胞核。本研究初步探索了HaNAC2基因的表达及定位,为进一步研究该基因在梭梭抗旱中的功能打下基础。     

水稻谷蛋白GluB-4基因启动子克隆及载体构建

GluB-4是水稻种子谷蛋白的编码基因,在种子成熟过程中,由GluB-4启动子调控,在胚乳中特异地表达。以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到GluB-4启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为1 560 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.8%。该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Skn-1基序等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件,同时还含有高水平转录调控因子5UTR Py-rich stretch序列。利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pCGB4P,为进一步的研究工作奠定了基础。     

水稻OsGLYI11.2基因启动子的克隆及表达分析

启动子对基因时空表达的调控具有关键作用。本研究利用PCR克隆了一个水稻乙二醛酶(Glyoxalase)基因Os GLYI11.2的启动子区域片段(GenBank:AB017042.1),利用PlantCARE对该片段进行了顺式作用元件分析;构建了pOsGLYI11.2∷GUS表达载体并通过农杆菌介导转入水稻中,通过检测转基因植株中GUS基因在不同器官中的表达,分析了启动子的表达调控模式。结果显示：该启动子含有调控基因表达的7类调控顺式元件,能驱动GUS基因在水稻不同组织中(胚,胚芽鞘,花)表达。说明本研究所克隆的OsGLYI11.2基因上游2 120 bp的DNA片段具有启动子活性,能够驱动报告基因的表达。本研究结果可为进一步研究OsGLYI11.2基因在水稻中的功能及其相关调控机制提供基础。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

棉花GaLMI1-like基因功能及其启动子表达分析

LMI1基因是叶片锯齿状结构发育调控的关键基因。为了研究棉花鸡脚叶发育的机理,通过PCR扩增技术从A基因组棉花亚洲棉石溪亚1号中克隆出GaLMI1-like基因及其启动子序列,大小分别为681,1 439 bp。结构域分析发现,GaLMI1-like蛋白含有与陆地棉中同源基因一样的homeobox结构域,进一步构建了GaLMI1-like基因过表达载体p6MYC-GaLMI1-like,转化拟南芥后验证了GaLMI1-like基因具有调控叶片缺刻表型发育的功能。对启动子序列进行顺式作用元件分析,发现其除了具有CACA-box和TATA-box等基本作用元件外,还具有光响应及根、茎和叶肉特异性表达相关元件。构建了GaLMI1-like启动子的GUS融合表达载体并转化拟南芥,GUS染色结果显示,该启动子能够驱动GUS基因在根中柱、茎和叶片中表达,其中在叶片中染色较深。上述结果表明,GaLMI1-like基因具有调控缺刻叶形成的功能,且此调控棉花叶形发育的功能是通过GaLMI1-like启动子调控其在叶片中强表达实现的。     

芒果GGPPS小亚基基因的克隆、进化和表达分析

香叶基焦磷酸(GPP)是香味成分单萜的前体物质,而香味是芒果重要的品质性状。本研究克隆了芒果中GPP合成关键酶基因,即香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因(MinGGPPSssu),并开展了系统进化分析和表达分析。从芒果栽培品种贵妃芒的新鲜叶片中提取DNA和RNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到Min GGPPSssu全长约1 kb的c DNA序列。通过测序、多重比对和聚类分析,证实该片段属于GGPPSssu的全长基因,且为最大的ORF。与近缘物种苦楝GGPPS1(KM108317)氨基酸序列同源性为83%。蛋白质序列分析表明该序列含有1个DDx_(2-4)D保守基元和一个Cxxx C基元。我们选取了拟南芥中12个GGPPS基因、2个FPPS基因、2个SPPS基因、一个GPS基因及其他物种的相关基因,通过聚类分析,将Min GGPPSssu聚类到香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基所属的枝。表达分析表明,该基因在叶片中表达量最高,茎部表达量较低。果皮和果肉在芒果成熟前后表达量相似,但是在果皮中的表达量约为果肉表达量的3倍,推测其与果皮及叶片香味调控相关。     

玫瑰RdGASA4-like基因启动子的分离及其在甘蓝中的瞬时表达分析

在前期的研究中,一个玫瑰RdGASA4-like基因的cDNA和DNA序列全长利用同源克隆结合RACE的方法首次得到克隆。为深入了解该基因在赤霉素调控植物发育过程中的作用,通过TAIL-PCR的方法首次克隆该基因起始密码子ATG上游685bp的5’-UTR和部分启动子序列,在启动子序列分析的基础上,构建其与GUS基因融合表达载体,命名为pBI-GP685。通过农杆菌介导的方法对甘蓝外植体子叶-子叶柄进行启动子瞬时表达研究,结果表明分离得到的启动子具有启动报告基因GUS表达的活性。     

巴西橡胶树NAC转录因子HbNAC1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究植物特有的NAC(NAM,ATAF1/2和CUC2)转录因子在巴西橡胶树生长发育、胁迫应答和激素调节中的功能,对巴西橡胶树NAC转录因子进行了克隆和分析。根据橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,利用RACE-PCR技术克隆了橡胶树HbNAC1的cDNA序列。生物信息学分析显示HbNAC1基因开放阅读框(ORF)为891 bp,编码了一个296个氨基酸组成的中性不稳定水溶性蛋白,该蛋白的N-端具有保守的NAC结构域,C-端高度变异,具备了NAC转录因子的基本特征。HbNAC1定位在细胞核中,具有3个糖基化位点和21个磷酸化位点,三级结构由3个α-螺旋和9个β-折叠组成。序列比对和系统进化分析显示HbNAC1蛋白属于NAC转录因子家族中的ANAC011亚族,推测其可能作为一种氨基酸合成相关的调节酶参与调控植物的免疫反应。     

香蕉MaCSase基因的克隆和表达分析

旨在克隆香蕉(Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian)半胱氨酸合成酶(cysteine synthase, CSase)基因,并进行序列特征、器官表达特异性和逆境胁迫下表达特性分析。通过对香蕉根的cDNA文库的测序和分析,获得了一段香蕉半胱氨酸合成酶基因的片段,运用RACE扩增技术获得基因全长,命名为MaCSase,并进行序列分析,最后利用荧光定量PCR技术分析该基因在香蕉不同器官中的表达特异性及在外源胁迫下的表达特性。序列分析显示,该基因全长1367 bp,存在1个完整的开放阅读框1065 bp,编码355个氨基酸。通过和已知植物的半胱氨酸合成酶基因相比,同源性达到79%以上。其中与水稻、苜蓿、葱、玉米的CSase编码的氨基酸序列的同源性分别为86%、85%、84%、84%,器官特异性分析表明,MaCSase在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,其中在球茎中表达量最高。通过对其在高盐胁迫下的表达分析显示,该基因在香蕉根中的表达随着处理时间的增加呈现上升趋势,在胁迫6 h时被大量诱导。     

鸭IGF-IR基因部分序列克隆、鉴定及在胚胎期胸肌组织中的差异表达分析

为了克隆分析鸭IGF-IR基因部分的cDNA序列,并研究该基因的组织表达规律。通过同源性比对,克隆了IGF-IR基因cDNA部分片段,并运用生物信息学方法分析了不同物种序列进化关系,运用荧光绝对定量PCR技术检测了IGF-IR mRNA在肉用型品种高邮鸭和蛋用型品种金定鸭胚胎期不同发育时期胸肌中的表达。序列分析结果表明：克隆得到的鸭IGF-IR基因cDNA270 bp片段长度,其核苷酸序列与鸡、人、小鼠、大鼠、猪、牛的IGF-IR基因相应核苷酸序列的同源性分别为95%、79%、78%、77%、78%、76%;荧光绝对定量结果表明：IGF-IR基因在胸肌中呈“波浪形”表达,在21胚龄表达量最高,与17、25、27胚龄和7日龄差异显著(P<0.05);IGF-IR基因在品种间表达量除21胚龄时差异显著外(P<0.05),其余各胚龄差异均不显著(P>0.05),表明IGF-IR mRNA的表达在所研究品种胚胎期的胸肌中相对稳定。     

水貂肠道酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

了获得水貂专用的有益菌种,以为研究毛皮动物益生菌制剂提供理论基础。从健康水貂的肠道中分离纯化出2株酵母菌,编号为JM1和JM2,进行了形态学观察、生理生化试验以及26S rDNA基因序列分析,并构建了系统发育进化树,同时对其生长情况和安全性等进行了综合鉴定。传统鉴定方法和26SrDNA D1/D2区序列分析结果表明：JM1为弗比恩毕赤酵母,菌株JM2为酿酒酵母;生长情况结果表明：2菌株在14~30 h生长较快,在30~40 h生长趋于平稳;2菌株培养液中糖度12 h时波美度开始急速下降,并且在26 h后有升高趋势;安全性试验显示：2菌株对小鼠均无毒性,且在2.73×107cfu/mL时小鼠生长速度最快。     

一株生防细菌的分离鉴定及其抑菌活性物质的分析

随着人们对农产品品质和安全性要求的提高,高效生物防治资源的筛选显得尤其重要。本研究通过平板对峙实验、分子鉴定、刚果红染色、葡聚糖酶基因克隆与序列分析等方法获得一株抑制多种植物病原真菌的芽孢杆菌,编号为YW26。16S rDNA基因序列分析表明该菌株为解淀粉芽孢杆菌;刚果红染色显示该菌株具有很强的产纤维素酶能力;根据GenBank数据库中芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(CP000560)序列设计引物,克隆得到1527 bp的片段,经测序、BLAST分析显示该片段与Bacillus amyloliquefaciens FZB42内切β-1,4-葡聚糖酶基因序列同源性为99%。该解淀粉芽孢杆菌抑菌效果显著,具有较强产纤维素酶能力。因此,该菌株可作为一种生防资源,开发新的生防制剂。     

红花檵木CHS基因的克隆与序列分析

查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第1个关键酶。根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物,以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为材料,用RT-PCR方法,分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为JQ609678）,将该基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp,编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%,与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上;其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达98%。     

苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)启动子区

通过研究苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)的启动子来探索MdGA3ox1的转录调控机制。采用染色体步移法结合锚定PCR法扩增了MdGA3ox1的上游序列,用PLANT CARE启动子分析软件分析此启动子序列,并把其构建到载体上,转化入根癌农杆菌中初步验证了其功能。获得一个754 bp的DNA序列,分析此序列发现有CAATbox、TATAbox、赤霉素、光、乙烯、脱落酸等顺式反应元件。把此序列构建到pCAMBIA 1381载体上,并把此质粒命名为p1381-GA3ox1p。把p1381-GA3ox1p转化入农杆菌EHA105中,利用GUS染色液染色,农杆菌呈蓝色。获得了MdGA3ox1的上游序列,此序列上含有与GA调节相关的顺式反应元件,并且初步证明此序列具有启动子活性。     

非生产期内不同橡胶苗生长比较研究

为了研究非生产期内不同砧木类型橡胶苗对橡胶树茎围生长和可开割率的影响,利用从同一批次苗木中按砧木大小及其胶乳分级后选出的4种袋装苗和籽苗芽接苗（袋装苗）,进行大田非生产期内的生长比较研究。结果表明：在定植时5种袋装苗之间的接穗直径存在显著差异,至开割前各种苗木茎围差异不显著,小苗和随机苗具有相对较快的茎围增长速率;定植7年后随机苗的可开割率最低,但达到开割标准;所有苗木的茎围生长呈现出规律性的增长,均拟合同一线性方程。说明对橡胶苗木进行分级后定植,有利于提高橡胶树的可开割率,非生产期内橡胶幼树的茎围生长呈线性增长。     

兔出血症病毒的鉴定及其系统发育分析

为确定临床家兔的死亡病因并对其病原进行研究分析,本试验通过临床症状、剖检变化和RT-PCR技术以及HA-HI试验对一起家兔的慢性死亡进行了诊断。结果表明：为兔出血症病毒感染引起的兔瘟。然后设计引物对该病毒的唯一结构蛋白VP60衣壳蛋白的全基因序列进行了RT-PCR扩增、测序和比对分析。结果显示：引起本次家兔死亡的兔出血症病毒的VP60长度与其他已知毒株一致,也是由1740个碱基组成,与已发表毒株的VP60的同源性达90%以上;在系统进化上与俄罗斯2009年的一个流行毒株同源性最高(98.1%)。本试验研究结果表明本次引起非典型兔瘟的兔出血症病毒仍然具有较高的保守性,但病毒的结构蛋白也发生了一些小的变异,这些变异成为基因亚群划分的依据。     

马氏珠母贝TLR2基因cDNA的分子特征及组织表达分析

TLR2（toll like receptor 2）是TLR模式识别受体家族的重要成员之一,参与有机体的免疫识别。本研究采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆获得了马氏珠母贝（Pinctada martensii）TLR2基因（PmTLR2）cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时检测了PmTLR2基因的mRNA在马氏珠母贝六个组织中的表达。结果表明：PmTLR2基因的cDNA全长2614 bp,包含41 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR,27 bp的polyA,开放阅读框为2274 bp,编码758个氨基酸残基。多序列比对显示PmTLR2与牡蛎TLR2的序列相似性最高,为51%;Smart软件分析显示PmTLR2的蛋白序列中含有8个亮氨酸重复序列（Leucine rich repeats,LRRs）, 1个C端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat C-terminal,LRR-CT）,1个N端亮氨酸富集区（Leucine-rich repeat N-terminal,LRR-NT）,1个TIR（Toll/IL-1R）同源结构域（TIR）;荧光定量PCR分析表明PmTLR2在马氏珠母贝肝胰脏、性腺、血淋巴、鳃、外套膜和闭壳肌六个组织中均有表达,鳃中表达量最高。本研究为进一步阐述PmTLR2在马氏珠母贝免疫应答中的作用机制提供理论基础。