香蕉MaWRKY18的克隆及表达特征分析

为了研究WRKY基因在香蕉与Foc TR4(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)互作中作用,利用RACE技术从香蕉中克隆获得了一个WRKY基因全长。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框,编码275个氨基酸,与香蕉A基因组预测出的(XP_009392153)成员的同源性为100%,因此将其命名为MaWRKY18。MaWRKY18与MaWRKY71(ADR71866)亲缘关系近,聚类在一个分支上。RT-PCR分析表明该基因在香蕉各器官(根、球茎、假茎、叶、花和果实)中均有表达。MaWRKY18受水杨酸和乙烯诱导上调表达,受茉莉酸诱导下调表达。亚细胞定位表明该基因编码的蛋白定位在细胞核中,且C端具有转录激活活性。在Foc TR4接种后,MaWRKY18在感病品种中下调表达,在抗病品种中上调表达。结果表明克隆到的MaWRKY18可能在香蕉与Foc TR4互作过程中介导抗病性。     

香蕉枯萎病菌myosin-1基因的功能分析及外施dsRNA介导的抗性评估

 香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense,Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中 4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。SMART在线软件分析myosin-1基因具有肌球蛋白马达蛋白(myosin motor domain, MMD),肌动蛋白尾结构TH1(myosin tail)和 Src家族同源结构域SH3(src homology domain 3),与禾谷镰刀菌中氰烯菌酯靶标基因myosin-5具高度的蛋白同源性,相似性高达83%。利用Split-marker基因重组技术获得Foc4的myosin-1基因敲除突变体,Δmyosin-1突变株丧失了对氰烯菌酯的敏感性,菌丝生长缓慢,产孢量减少且孢子畸形,对香蕉致病力严重下降,证实myosin-1是氰烯菌酯在Foc4中的作用靶标基因。外施靶向myosin-1体外转录的dsRNA,能抑制菌丝的生长,降低菌丝活性;菌丝膨胀扭曲分枝增多,出现典型的球状结构,与氰烯菌酯处理后的表型一致。在盆栽活体人工接种实验中,体外施用dsRNA可以明显抑制枯萎病外部症状的发展,推迟发病时间,赋予寄主抗性,结果说明体外施用dsRNA可以作为新型杀菌剂防治香蕉枯萎病。综上,myosin-1基因作为氰烯菌酯在Foc4中的靶标基因具有高度的序列保守,在调控菌丝生长发育,产孢以及致病力等方面发挥重要作用,而外施dsRNA具有防治香蕉枯萎菌的巨大潜力。     

香蕉枯萎病菌SIX2基因序列及特异性分析

依据侵染的香蕉品种范围不同,引起香蕉枯萎病的尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)分为4个生理小种。Foc在寄主植物木质部分泌的SIX(secreted in xylem)蛋白可能与不同生理小种侵染的香蕉品种范围不同存在密切关系,找到Foc 4号生理小种(Foc4)特有的SIX蛋白编码基因将有利于进一步分析Foc4寄主范围更广的原因,从而开展抗病育种工作。采用PCR方法比较分析了国内不同地理区域及来源于澳大利亚与南非的Foc1、Foc2、Foc3、Foc4共56株菌株中的SIX2基因,并以8个以上其他专化型或其他种或属的热带作物病原菌共39株菌株分析了Foc4 SIX2基因序列的特异性,分析了SIX2基因的灵敏度及利用其检测感病植株。仅从供试的Foc4菌株基因组DNA中扩增出SIX2基因序列,检测的DNA灵敏度达5pg/25μL,并可用于检测感病的球茎组织。Foc4中特有的SIX2基因序列为特异性鉴定感病植株病原菌种类提供了快速分子检测技术,为明确该基因是否决定性影响Foc4对寄主差异性的选择研究提供了基础。     

香蕉细菌性软腐病菌tus基因对细菌生物被膜形成的影响

为解析硫转运蛋白(tRNA 2-thiouridine synthesizing protein,tus)基因对香蕉细菌性软腐病病原细菌——玉米迪基氏菌Dickeya zeae生物被膜形成的影响，采用同源重组方法构建6株tus基因的缺失突变体及回补菌株，分析代表性突变体的转录组差异，并测定不同突变体的运动能力、细胞壁降解酶分泌水平以及对烟草的致敏性和对寄主的毒力，解析突变体生物被膜表型发生变异的原因。结果显示，玉米迪基氏菌的6株tus基因缺失突变体ΔtusA、ΔtusB、ΔtusC、ΔtusD、ΔtusE和ΔmnmA均表现出生物被膜表型缺陷；ΔtusC突变体转录组比较分析表明，细菌生物被膜形成和运动性相关基因均属于细胞进程中的显著下调表达基因，且前者主要为Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)基因，进一步分析发现3个位点的T6SS基因均出现显著下调表达趋势；6株tus基因缺失突变体的运动能力显著减弱，但是细胞壁降解酶分泌水平和对烟草的致敏性并未发生显著变化；接种野生型菌株和基因回补菌株后香蕉的病情指数为42.5～67.5，而接种突变体后香蕉的病情指数...     

苹果树腐烂病菌含cupin结构域蛋白Vmcupin1的鉴定及功能分析

由苹果黑腐皮壳(Valsa mali)侵染引起的苹果树腐烂病是严重威胁我国苹果产业健康发展的重大枝干病害。揭示病菌致病机理有助于制定病害防控新策略。含cupin结构域蛋白是一个大的蛋白家族，广泛参与植物发育和逆境胁迫响应等多种生命活动。有关植物病原真菌中该类蛋白的研究报道很少，其参与菌丝生长和侵染致病的生物学功能尚不明确。基于V.mali与苹果树皮互作的转录组分析，发现一个在病菌侵染过程中显著上调表达的基因。蛋白序列特征分析发现，该蛋白含有1个典型的cupin结构域，且与其他物种含cupin结构域蛋白高度同源，将之命名为Vmcupin1。实时荧光定量分析发现Vmcupin1在病菌侵染过程中显著上调表达。创制了Vmcupin1缺失突变体和回补菌株，发现该基因缺失后，病菌生长速率在一定程度上降低，其致病力和适应H₂O₂和NaCl胁迫的能力显著降低，表明Vmcupin1在病菌营养生长、侵染致病，以及逆境胁迫中发挥重要功能。研究结果丰富了真菌含cupin结构域蛋白功能的认知，有助于全面解析腐烂病菌致病机理。     

甘蔗镰孢菌质子偶联寡聚肽转运蛋白基因FsPTR2E的功能研究

甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是引起甘蔗梢腐病的主要病原菌之一,明确其致病机理对于探寻甘蔗梢腐病防治策略具有重要意义。质子偶联寡聚肽转运蛋白由质子移动力提供能量,转运二肽、三肽等氮源,在生物体生长发育过程中发挥着至关重要的作用。本文对F.sacchari中一个与质子偶联寡聚肽转运蛋白编码基因高度同源的基因FsPTR2E在病菌大型分生孢子形成过程及侵染阶段的表达模式进行分析,同时对FsPTR2E敲除突变体(ΔFsPTR2E)的主要生物学特性进行研究。结果表明,1)同在常规培养基(PDA)上相比,F.sacchari在大型分生孢子诱导培养基上培养24～72 h,FsPTR2E的表达量显著升高;2)F.sacchari侵染寄主72 h时,FsPTR2E的表达量和菌丝阶段相比显著下降;3)敲除FsPTR2E不影响病菌生长、孢子萌发以及对逆境胁迫的响应,但是敲除突变体ΔFsPTR2E的大型分生孢子和小型分生孢子的产量和野生型菌株相比均显著降低;4)ΔFsPTR2E的致病力较野生型菌株显著增强;5)同野生型菌株一样,ΔFsPTR2E可以在以二肽为唯一氮源的培养基上正常生长。这些结...     

苦瓜枯萎病菌Ⅱ型卤酸脱卤酶基因FoHAD-type Ⅱ功能分析

苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.momordicae Sun&Huang)侵染引起的一种严重制约苦瓜安全生产的土传病害。明确苦瓜枯萎病菌的致病机理对苦瓜枯萎病的防治具有重要的指导意义,但目前苦瓜枯萎病菌的致病机理尚不明确。前期分析苦瓜枯萎病菌强致病力菌株SD-1和弱致病力菌株SD-V(携带真菌病毒)转录组差异表达基因时,发现Ⅱ型卤酸脱卤酶(FoHAD-typeⅡ)基因在SD-V菌株中表达量显著下调,推测该基因与苦瓜枯萎病菌的致病性相关。本研究根据同源重组的原理,利用分割标记法(Split-Marker PCR)获得了FoHAD-typeⅡ基因的融合片段,分别通过PEG介导的原生质体转化和农杆菌介导的遗传转化获得该基因的敲除突变体和回补突变体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行了分析。结果表明,敲除突变体的生长速率和产孢量与野生型菌株相比没有显著差异,菌丝尖端形态和孢子形态也无明显差异,但气生菌丝减少,对渗透胁迫耐受性降低,致病力显著下降;回补突变体的生物学性状和致病力与野生型菌株一致。表明FoHAD-typeⅡ基因...     

水稻条斑病菌异柠檬酸脱氢酶在致病性中的功能分析

 异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IcdH)催化异柠檬酸转化成α-酮戊二酸,参与碳代谢途径末端的三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环。然而,编码异柠檬酸脱氢酶基因是否参与水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)的致病性,我们并不清楚。为了阐明IcdH的作用,通过同源重组技术获得了Xoc的icdH基因缺失突变体(RΔicdH),并对该突变体进行了相关功能研究。研究表明:该突变体不能利用苹果酸、丙酮酸和柠檬酸,在寄主水稻上的生长能力和致病力相对于野生型均显著降低,其游动性也显著减弱; 功能互补子恢复RΔicdH的上述表型至野生型水平; Real-time PCR结果显示,六碳单糖、蔗糖、苹果酸、丙酮酸与柠檬酸能显著诱导icdH基因的转录表达;与水稻细胞互作时icdH基因受诱导表达,并受HrpX和HrpG负调控。这些结果说明:icdH基因是Xoc获取碳源和在寄主水稻上具有致病性所需的。     

FoAP1基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析

 为了探究AP1转录因子在尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中是否参与香蕉枯萎病的致病过程，借助尖孢镰刀菌Fo5176菌株(GenBank序列号:AFQF01001482.1)全基因组序列，通过PCR和RT-PCR技术克隆获得了Foc4中AP1转录因子的基因组DNA和cDNA编码序列.利用PEG介导的原生质体转化法获得AP1基因敲除转化子。利用qRT-PCR分析AP1可能调控的下游基因表达。利用灌根法(直接在根部浇菌)检测了AP1缺失突变体的致病能力。结果表明Foc4的AP1转录因子cDNA编码序列长1770bp，编码63.9kDa(589aa)蛋白，是一个典型的bZIP型转录因子，命名为FoAP1;FoAP1缺失突变体的气生菌丝大量减少，菌丝的入侵生长受到严重限制。对外源氧化胁迫不敏感，但致病能力减弱。     

大豆斑疹病菌羧基蛋白酶前体基因的功能分析

 大豆斑疹病菌(Xanthomonas axonopodis pv. glycines,Xag)具有强烈的胞外蛋白酶活性,然而编码其羧基蛋白酶前体(xanthomonappepsin precursor,Xpp)的xpp基因是否参与Xag的蛋白酶活性与致病性,并不清楚。为了阐明Xpp的作用,通过同源重组技术获得了Xag的xpp基因缺失突变体(NΔxpp),并对其功能进行研究。研究表明:该突变体在寄主大豆上的生长能力和致病力相对于野生型均显著降低;功能互补恢复NΔxpp的植物表型至野生型水平。蛋白酶实验表明,NΔxpp胞外蛋白酶活性相对于野生型并无变化;而且xpp基因异源表达也不具有蛋白酶活性。qRT-PCR结果显示,DSF(diffusible signal factor)信号通路及Clp(Crp-like protein)显著负调控xpp基因的转录表达;与大豆汁液互作时xpp基因受诱导表达,并受HrpX和HrpG正调控。这些结果说明:xpp基因不参与Xag的蛋白酶活性,但其是病原菌在寄主大豆上具有致病力所需的。     

欧美杨细菌性溃疡病菌双组份系统反应调节基因LqRR2的功能研究

由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的欧美杨溃疡病于2006年在国内首次发现,不同于其它病原菌造成的杨树溃疡病,该病害对欧美杨速生林的生长造成毁灭性破坏,已造成了严重的经济损失,该病原菌的致病分子机制尚不清楚。双组分系统是细菌重要的信号传递通路,在细菌的生长繁殖、逆境胁迫应答、环境适应以及病原菌致病过程中发挥重要作用。开展双组份系统研究将有助于解析欧美杨细菌性溃疡病菌的致病机制。本研究鉴定了欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina双组份孤儿反应调节基因LqRR2,并对其生物学功能进行了研究。通过同源重组获得了LqRR2基因的缺失突变体△LqRR2。表型测定结果显示,与野生型菌株相比,突变体△LqRR2在半固体培养基上的游动能力显著减弱,对欧美杨‘107杨’枝干的毒性也显著降低。但是,突变体的生长速率、生物膜形成能力以及胞外多糖产量较野生型无显著差别。此外,荧光定量PCR分析结果显示,游动性相关基因flg B、flg C和flg E的表达量在突变体中明显降低。综上所述,双组份调节蛋白编码基因LqRR2是欧美杨细菌性溃疡病菌L.quercina维持病原菌游动性和全毒性所必需的。     

香蕉枯萎病菌TR4原生质体转化和基因敲除体系构建

正香蕉枯萎病是一种典型的维管束和土传真菌病害,也是最具毁灭性的植物病害之一~([1])。香蕉一旦感病,很难结果,而且目前尚无有效的防治措施~([1])。因此,研究植物病原菌侵染进程和致病机制,可以拓宽思路以寻求植物病害防治新途径。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)侵染所致~([1])。对生产影响最大的Foc是侵染包括大蜜哈、     

转录因子FoSwi6调控香蕉枯萎病菌的生理特性和致病性

 香蕉枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) 是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。为了解析该病原菌的致病机理和探索新的防治途径,本研究利用同源重组的方法获得了转录因子FoSwi6的敲除突变体菌株,与野生种菌株相比,敲除突变体菌株 ΔFoSwi6表现为生长缓慢、气生菌丝显著减少且部分菌丝膨大畸形、产孢量降低、对H₂O₂过敏感、镰刀菌酸合成相关基因FoFUB4的表达量下调及致病性减弱。由此表明, FoSwi6 参与调控香蕉枯萎病菌的生理特性和致病性。     

基于RNA-seq 的香蕉枯萎病菌转录因子FoSwi6敲除突变体的转录组分析

 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase,MAPK)信号通路转录因子 FoSwi6 在调控香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4)的生理特性和致病性方面发挥着重要作用。为解析转录因子 FoSwi6 的转录调控机制,本研究利用RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和突变体ΔFoSwi6的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有 5 728 个,其中上调表达基因有 2 682 个,下调表达基因有 3 046 个。Gene Ontology功能分析表明,差异表达基因主要富集在生物学过程(biological process)中的代谢过程(metabolic process)、细胞过程(cellular process)和单细胞过程(single-organism process),分子功能(molecular function)组分中的催化活性(catalytic activity)和结合(binding)区域。KEGG 显著性富集分析表明,差异表达基因主要富集在核糖体、乙醛酸和二羧酸代谢、氨基酸合成和 2-氧代环戊烷羧酸甲酯代谢通路。差异表达基因的in silico 分析,揭示其中12个基因可能参与调控Foc4的产孢、生长发育、氧化应激反应、细胞壁合成、甾醇合成、氮素吸收、毒素合成和致病性。该研究为阐明香蕉枯萎病菌的致病机理奠定了理论基础。     

不同抗性黄瓜品种连作对枯萎病菌群体遗传分化的影响

 尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Foc)是引起黄瓜枯萎病的病原真菌,为了明确不同抗性黄瓜品种连作对枯萎病菌遗传分化的影响,本研究采用TEF1-α、H3基因片段对不同抗性黄瓜品种连作及对轮作后分离的枯萎病菌群体进行遗传分化分析。结果表明,感病品种连作及轮作后菌群分化程度较低( 0.007< F_ST <0.045 );与种植抗病品种一茬后的菌群相比,连作三、五茬后的菌群均发生显著分化(F_ST > 0.050),其中连作三茬后的菌群遗传分化程度最高(F_ST > 0.300)。单倍型分析发现,抗、感病品种连作后部分菌株形成新的单倍型,且分离自抗病品种的病原菌群体分化产生的单倍型数量多于感病品种。主成分分析结果进一步证明,与感病品种连作及轮作相比,抗病品种连作后病原菌菌群呈现出更显著的菌群分化。综上所述,抗病品种连作能够加剧黄瓜枯萎病菌群体的遗传分化。     

利用香蕉水培系统测定枯萎病病原菌致病力

 为建立一种评价香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)菌株间致病力差异的体系,在改进的香蕉水培系统基础上,对影响香蕉枯萎病菌致病力的接种菌液浓度、类型及处理方式等因素开展分析,同时与不同菌株盆栽测定结果进行比较以验证该方法的可靠性。结果表明:在香蕉水培系统下,将摇培5 d的菌液稀释10倍以上,使孢子初始浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1,直接加入该菌液50 mL即可用于致病力评价,且不同菌株用该测定方法与盆栽测定的致病力结果基本一致。该方法的建立为香蕉枯萎病菌致病力的评价提供了快速简便的方法,也为下一步解析尖孢镰刀菌致病相关基因功能和致病机理及抗病品种的选育奠定了基础。     

西瓜噬酸菌铁吸收调控因子furA的功能研究

 铁吸收调控因子(Ferric uptake regulator,Fur)是细菌中主要调控铁代谢的重要调控蛋白,也影响氧化应激和致病性。生物信息学分析显示,西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)中存在2个Fur蛋白,其生物学功能未知。本文以其中之一的furA为研究对象,通过同源重组原理,构建了野生型菌株Aac5的furA缺失菌株ΔfurA和互补菌株ΔfurAcomp,并进行了致病力和其他相关生物学表型的测定。结果显示,furA缺失后,显著降低了Ac对西瓜、甜瓜的致病力、运动能力、产铁载体能力,提高了生物膜形成能力、以及对Fe³⁺、过氧化氢和链黑菌素的敏感性;基因表达量分析结果显示,furA影响与铁代谢、应激反应和致病性相关基因的表达。综上所述FurA在Ac致病过程、铁代谢和其他表型中起着重要的调控作用。     

水稻细菌性条斑病菌中一个调控致病性的DNA结合蛋白负调控胞外酶活性

 原核革兰氏阴性菌稻黄单胞菌稻生致病变种 (又称水稻细菌性条斑病菌,Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是引起水稻细菌性条斑病的病原物,该病是水稻粮食生产中的严重病害之一。我们的前期工作对广西农科院分离到的Xoc菌株GX01进行基因组序列分析,发现一个编号为gx01_0566的基因可能编码一个Fis家族的DNA结合蛋白。本工作采用自杀质粒pK18mobsacB介导的方法来构建该基因的缺失突变体,并对突变体进行反式互补。表型分析发现,gx01_0566基因的突变体在寄主水稻日本晴上的致病力显著下降,但其胞外多糖产量与野生型基本一致,胞外酶尤其是胞外纤维素酶活性却大幅度提高。为进一步研究gx01_0566基因在Xoc中调控胞外纤维素酶的机理,我们对该基因的产物进行过量表达和纯化,并通过凝胶阻滞实验和实时定量PCR实验分析,发现gx01_0566编码产物能够结合在一些编码纤维素酶的基因的启动子上,负调控这些纤维素酶基因的表达。