痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR检测

研究成功建立了痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR(Semi-nested PCR)检测方法，灵敏度比常规PCR提高了100倍。该方法通过改良CTAB法提取并纯化得到不同梯度浓度的DNA模板溶液。设计了4个外源基因的特异性半巢式PCR引物，以油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内标准基因，对油菜籽混合样品中外源FMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE基因进行了检测，灵敏度达到0.001%。     

柑橘黄龙病可视化LAMP检测技术的建立及应用

建立柑橘黄龙病(HLB)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,为HLB的快速检测提供有力的技术支持。根据LAMP技术原理,针对柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个位点设计4条特异性引物,通过对反应体系和反应条件的优化,并在反应前的体系中加入1∶10的钙黄绿素(calcein)和氯化锰(MnCl2)混合液作为荧光显色剂,建立可视化LAMP检测技术,同时对该技术的特异性、灵敏度和样品检测进行了测试。该检测方法具有很高的特异性,反应体系中除了HLB具有特异性的扩增,产生黄绿色荧光扩增产物,其他供试菌株均无特异扩增。对柑橘黄龙病菌总DNA的检测限为1.51×10-3 ng/μL,而对含有目的基因的CG-pMD18-T质粒DNA的检测限为2.12×10-6 ng/μL,与定量PCR灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1 000倍。利用可视化LAMP技术和定量PCR对来自漳州、南平、福州等地的样品进行检测,结果 2种技术的检出率均为76.7%,符合率达到100%。     

巢式PCR检测琯溪蜜柚黑斑病病原菌

利用特异性引物从琯溪蜜柚黑斑病菌基因组DNA中扩增出一条分子量为487 bp的特异性条带,准确地与疮痂病、炭疽病和黄斑病菌等蜜柚常发性真菌病害区分开.采用巢式PCR对该引物的检测灵敏度进行测定,结果显示,对于黑斑病菌基因组DNA,巢式PCR的检测灵敏度为100 fg/μL,灵敏度比常规PCR至少提高100倍;对于发病组织,巢式PCR可从病斑组织含量为100 μg的DNA样品中检测到黑斑病菌.采用巢式PCR检测技术,可从蜜柚的黑斑病显症组织和未显症组织特异性地检测到病原菌,且检出率分别为96.67％和90％.     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

海南长春花变叶病病原物的分子鉴定

本研究分别利用植原体16S rDNA和核糖体蛋白(ribosomal protein,rp)基因的通用引物对自然表现变叶症状的海南长春花样品总DNA进行PCR扩增,获得16S rDNA基因片段长为1 432 bp,rp基因片段长为1 211 bp。BLAST程序比较、系统进化树构建及iPhyClassifier分析表明:海南长春花变叶病是由植原体引起的,该植原体株系属于16S rⅠ-B亚组,与候选种Ca.Phytoplasma asteris相关,将其暂命名为长春花变叶病植原体海南株系(Periwinkle phyllody strain Hainan,PP-Hn)。     

南洋楹溃疡病菌巢式PCR快速检测

由可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）引致的溃疡病是目前威胁南洋楹健康生产和品质的重要病害。快速、准确检测病原菌是进行病害有效防控的基础。本研究用南洋楹溃疡病菌翻译延伸因子（EF 1-α）编码基因上保守靶基因区域的序列设计特异性引物EF-AF/AR。利用EF 1-α编码基因通用引物EF-688F/986R和特异性引物EF-AF/AR组合进行巢式PCR扩增,获得264 bp的单一条带,灵敏度检测最低限度为1 fg/μL。利用建立的巢式PCR方法对林间疑似溃疡病的病样进行检测,能够特异性地检测到L. theobromae。本研究建立的巢式PCR检测方法准确、特异且灵敏性高,可为南洋楹溃疡病的早期诊断和及时防控提供基础的理论和实践依据。     

进口大豆中菜豆晕疫病菌巢式PCR检测方法的建立

为实现对进口大豆样品中菜豆晕疫病菌的快速检测,本研究根据菜豆晕疫病菌的argK特异性序列设计引物52B/8F和24B/24F,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。试验结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆晕疫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR检测方法对菜豆晕疫病菌基因组DNA和菌悬液检测时,其灵敏度分别达到0.916×10-4ng/μL和2.4×103CFU/m L,比常规PCR灵敏度高1 000倍。在对100份进口大豆样品检测时,3份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明3份大豆样品中携带的病菌确实为菜豆晕疫病菌。本研究所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

多聚酶对转基因产品PCR检测的影响分析

本文参考出入境检验检疫行业标准中转基因油菜外源基因的PCR检测体系,分析了18种不同DNA聚合酶对定性PCR检测转基因油菜OXY235中的CaMV35S启动子的影响。结果表明,不同DNA聚合酶对CaMV35S启动子定性PCR检测中非特异扩增的产生以及检测灵敏度影响较大。其中热启动Taq酶效果较好,目标条带清晰,检测灵敏度高,而且完全没有非特异性扩增条带,非常适合用于定性PCR检测。对于同样条件下无法有效扩增0.1%DNA样品的Taq酶,则不推荐用于检测途径。     

PCR对转基因玉米MON810的鉴定检测

本研究成功建立了商业化种植的转基因玉米MON810的筛选检测和品种鉴定的PCR方法.该方法根据玉米自身IVR基因作为内源特异参照基因扩增226 bp片段,检查模板DNA提取的质量,避免了假阴性结果;同时扩增CaMV35S启动子基因195 bp片段,可以对MON810转基因玉米进行筛选检测;此外,根据MON810品种设计的特异性鉴定检测引物,可扩增Maize genome/CaMV35S基因170 bp片段和HSP/CryIA(b)基因194bp片段,具有很强的品种特异性,达到了对MON810转基因玉米的品种鉴定目的.PCR反应循环参数是94℃2 min;94℃40sec,55℃60sec,72℃60sec,35次循环;之后72℃延伸5 min。     

应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌

根据马铃薯环腐病菌16SrDNA基因片段核苷酸序列设计引物(引物1∶5-′TGTACTCGGCCAT-GACGTTGG-3′和引物2∶5-′TACTGGGTCATGTTGGT-3)′,进行马铃薯环腐病菌PCR特异性扩增试验。合成的引物能从马铃薯环腐病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增环腐病菌16SrDNA基因片段1046bp。该试验结果为马铃薯环腐病的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法。     

小麦中转基因成分PCR与实时荧光PCR的定性检测低限

为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求.     

利用PCR方法从苎麻中检测出粉虱传双生病毒

从苎麻植株上采集了叶片呈现花叶和黄绿斑驳并扭曲的2个病样.用粉虱传双生病毒简并引物对2个样品进行了PCR检测,结果发现2个样品都能扩增到预期大小的DNA片段.PCR产物经克隆后进行序列测定,BLAST比对结果表明,此样品的DNA扩增片断序列与Hsinchu番茄曲叶病毒福建分离物(EF125190,EF125191)和台湾分离物(DQ866131)的同源性都为95%,推测侵染苎麻的双生病毒可能是Hsinchu番茄曲叶病毒.     

基于PCR和巢式PCR技术的甘蔗黑穗病早期检测

为了探索甘蔗黑穗病早期检测的可能性,应用本实验室已建立的甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR检测技术,对经人工接种甘蔗黑穗病菌冬孢子的植蔗叶片进行检测,并调查采样植株的黑穗病实际发生情况。结果表明,黑穗病实际发生率80％（16/20）,PCR检测阳性率35％（7/20）,巢式PCR检测阳性率70％（14/20）,PCR和巢式PCR检测为阳性的样品,其植株黑穗病发生率几乎为100％。这一结果表明了甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR可用于甘蔗黑穗病早期检测,但巢式PCR检测结果与黑穗病的实际发生情况比较吻合,更适合于甘     

玉米丝黑穗病菌PCR检测

利用玉米丝黑穗病菌基因组特异引物PCR技术,检测了该菌对玉米植株的侵染状况,并对不同玉米品种在苗期对丝黑穗病菌的抗性进行了初步判断。研究结果表明,感病品种K12分别在接种后第3 d的茎中,6 d的茎,9 d的根、茎、叶,12 d茎,抗病品种20060分别在接种后第3 d的茎、6 d的茎、9 d的茎和叶、12 d的茎和15 d叶都能扩增出PCR特异片段,经过EM种衣剂包衣的玉米幼苗的根茎叶材料扩增出来的特异DNA条带明显少于未经包衣的玉米幼苗。EM包衣处理能够有效的提高玉米种子的抗病能力,减少了玉米丝黑穗病菌对幼苗的侵染机会,有效地防治了玉米丝黑穗病。     

玉米丝黑穗病菌的PCR检测

A pair of species-specific primer for sporisorium reilianum was designed according to the pra3 gene of sporisorium reilianum,and the results of polymerase chain reaction showed that a 499bp DNA was amplified by using the primers,and the PCR-based assay could detect more than 1pg fungal DNA using the primer.The PCR as a highly sensitive and reliable tool,could be used in detection of sporisorium reilianum.     

转基因植物中标记基因定性PCR检测方法研究

为了建立以标记基因为检测靶标的高效定性检测方法,本研究系统地分析了目前中请商业化的转基因植物中标记基因的应用频率,选取了应用频率高或在未来应用潜力大的标记基因neomycin phosphotransferasell (NPTII)、phosphinothricin acetyltransferase(PAT)、5- ...     

PCR-ELISA方法在转基因大豆检测中的应用

利用共价交联在PCR管上的瓜核苷酸作为固相引物进行PCR扩增，扩增产物可分为固定在管壁上的固相产物和游离在液体中的液相产物。分别对两种产物进行检测分析，进行双重检测，灵敏度高。可靠性强，易于操作，是适合推广的一种转基因大豆检测的快速方法。     

茶毛虫感染核型多角体病毒(EpNPV)的快速分子鉴定

根据茶毛虫核型多角体病毒(Euproctis pseudoconspera nuclear polyhedrosis virus,EpNPV)两个核心基因A13-1lef-8和A13-1polyhedrin的核苷酸序列,设计合成了两对特异性引物,应用PCR方法分别扩增获得538bp和281bp的2个DNA片段。克隆至T载体测序后与Genbank中已知EpNPV两基因序列比对,匹配率为100%。证实所克隆的特异性DNA片段可以作为鉴定茶毛虫感染EpNPV的标志性序列。本研究建立了茶毛虫感染EpNPV的分子鉴定方法,并为EpNPV防治茶毛虫效果的评价以及EpNPV侵染茶毛虫途径等毒理学研究提供依据。     

玉米丝黑穗病侵染率与发病率关系的PCR检测分析

用2个感病的玉米材料接种玉米丝黑穗病菌,苗期调查侵染率,开花期调查发病率,结果表明侵染率显著高于发病率;在开花期提取未发病植株茎髓组织DNA进行PCR检测,结果检测到玉米丝黑穗病菌DNA的存在。因此,通常情况下玉米丝黑穗病侵染率大于发病率。