花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技术构建表达载体

【目的】为进一步探究花椰菜ERF114基因功能,从花椰菜中克隆ERF114基因并构建植物表达载体。【方法】利用RTPCR技术从花椰菜中分离ERF114基因;通过生物信息学软件对ERF114蛋白特性进行预测和分析;采用Gateway技术构建ERF114基因的植物表达载体。【结果】克隆获得了花椰菜ERF114基因,其全长为681 bp,编码226个氨基酸,具有1个AP2结构域。生物信息学分析显示,该蛋白质为亲水性蛋白,有1个跨膜区域,二级结构以α-螺旋,β-折叠和无规则卷曲结构为主。进化树分析表明,花椰菜ERF114与油菜的亲缘关系最近。同时成功构建了植物表达载体。【结论】成功克隆了花椰菜ERF114基因,对其进行生物信息学分析,并构建其表达载体,为探究花椰菜ERF114基因功能及分子调控机制奠定了基础。     

蓝莓AP2/ERF基因家族鉴定及其在休眠解除过程中的表达分析研究

通过生物信息学鉴定蓝莓AP2/ERF基因家族成员,本研究在蓝莓中鉴定到160个AP2/ERF家族基因,通过进化树和基序分析,其家族成员可划分为AP2、ERF、RAV3个亚家族。氨基酸序列比对和保守结构域分析结果表明,蓝莓AP2/ERF家族成员均含有AP2结构域。启动子顺式作用元件分析表明,ERF基因启动子含有大量光反应、防御应激、脱落酸、赤霉素等响应元件。为了了解蓝莓ERF基因在花芽休眠中的功能,通过转录组表达谱分析发现,多数VcERF基因在蓝莓花芽休眠解除过程中均能表达,不同基因在冷积累下的表达量不同,在休眠解除过程中的表达模式同样存在差异。     

麻疯树油体钙蛋白JcCale26.8基因克隆及序列分析

[目的]克隆麻疯树(Jatrapha curcas)油体钙蛋白基因JcCale26.8全长cDNA序列，探究麻疯树油体钙蛋白及其基因的结构与功能。[方法]应用RNA-seq测序和PCR技术，从麻疯树种子中克隆获得1个油体钙蛋白家族基因JcCale26.8,并进行测序和序列分析。[结果]JcCale26.8基因序列含有6个外显子和5个内含子，内含子剪接位点符合真核生物基因的GT-AG法则。JcCale26.8基因mRNA序列的完整开放阅读框长717 bp,推测编码由238个氨基酸组成、相对分子量为26.8 kD的油体钙蛋白JcCale26.8。JcCale26.8蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲结构构成，并具有油体钙蛋白典型结构特征，与来自蓖麻、川桑和异色山黄麻等多个不同物种的Caleosin蛋白具有较高的同源相似性。[结论]该研究可为麻疯树油体钙蛋白基因的表达调控与功能研究奠定基础。     

麻疯树JcFAD7基因启动子克隆及植物表达载体构建

利用TAIL-PCR技术成功克隆了麻疯树JcFAD7基因起始密码子的上游1926bp序列。利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析表明,该序列含有4个TATA-box和6个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫响应元件,说明JcFAD7的表达可能受多种因素的调控。将启动子连接到pBI101.1载体,成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。为阐明麻疯树不饱和脂肪酸的合成代谢过程和植物生长发育的调控机理奠定了基础。     

石栗accD因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆石栗幼嫩叶片accD基因的全长cDNA序列,为今后利用该基因和提高油料作物种子含油量提供参考.[方法]根据已知植物麻疯树、蓖麻等accD基因的保守区域设计简并引物,以石栗幼嫩叶片为材料,利用简并PCR和RACE技术克隆accD基因的全长cDNA序列,扩增其编码序列.[结果]扩增获得的石栗accD基因全长cDNA序列长1789 bp,包含1509 bp的开放阅读框,可编码503个氨基酸,GenBank登录号为KC255250,并命名为amaccD.石栗accD基因序列经BLASTx比对后,发现其与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树氨基酸序列的同源性分别为90％、90％和89％.[结论]克隆获得的石栗accD基因全长cDNA序列与巴西橡胶树、蓖麻和麻疯树等具有较高同源性.     

青花菜WRI4基因的克隆、生物信息学分析及表达载体的构建

AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)是一个庞大的转录因子超家族,其蛋白质中均含有1段或2段由60～70个氨基酸残基组成的结构域,该家族基因广泛存在于植物体内,在植物生长发育,生物及非生物胁迫响应,植物次级代谢中均发挥着重要的作用.本试验利用前期的青花菜转录组数据,采用RT-PCR技术从青花菜中分离克隆WRI4基因,利用生物信息学分析软件对其进行基因结构及特征分析.结果表明,青花菜WRI4转录因子基因共编码308个氨基酸,WRI4具有2个AP2/ERF结构域,属于AP2/ERF家族成员.WRI4蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构,二级结构以无规则卷曲和α-螺旋,β-转角为主.氨基酸序列比对及进化树分析结果表明,青花菜WRI4转录因子与白菜、油菜相应的转录因子有较高的相似性.采用同源重组技术构建了WRI4过表达载体,为进一步深入探究该转录因子的功能,培育青花菜新品种奠定了基础.     

光皮桦AP2/ERF基因家族鉴定与表达分析

  目的  深入研究AP2/ERF基因家族在光皮桦Betula luminifera生长发育及环境胁迫响应中的生物学功能。  方法  利用光皮桦基因组数据,通过生物信息学方法开展AP2/ERF基因家族鉴定、基因特征、系统进化、基因结构、保守基序、顺式作用元件、蛋白互作和表达分析。  结果  在光皮桦基因组中共鉴定到77个AP2/ERF基因,其编码的蛋白理化性质存在差异,大多数蛋白(60个)的理论等电点小于7.0。系统进化分析显示:这77个AP2/ERF转录因子属于5个亚家族,其中ERF亚家族最大,包含34个成员。光皮桦AP2/ERF各亚家族间的基因结构存在较大差异,其中AP2亚家族成员均具有6~9个内含子,而DREB亚家族基因则没有内含子;但AP2/ERF各亚家族内的不同成员具有相似的保守基序类型和分布。同时,AP2/ERF基因启动子上都存在大量与激素、调节、胁迫响应及生长发育相关的顺式作用元件。此外,互作网络分析预测不同的光皮桦AP2/ERF亚家族蛋白间存在广泛的互作关系。进一步的表达分析显示:绝大多数光皮桦AP2/ERF基因(71个)的表达存在较强组织特异性,且在高温胁迫下,多数ERF或DREB基因的表达发生显著变化,表明ERF和DREB基因在高温胁迫应答中可能发挥着重要作用。  结论  通过生物信息学分析获得光皮桦77个AP2/ERF基因,分属于5个亚家族。不同亚家族基因具有相似的基因结构、保守基序等特征。基因启动子区含激素、胁迫响应等相关的作用元件。基因表达具有较强的组织特异性,且多数ERF或DREB基因对高温胁迫有明显响应。图6表1参39     

杨树AP2/ERF转录因子家族生物信息学分析

AP2/ERF基因家族是植物所特有的一类转录因子,该转录因子参与多种生物学过程,包括植物生长、花发育、果实发育、种子发育、损伤、病菌防御、高盐、干旱等环境胁迫响应等。从毛果杨基因组数据库中查找210个毛果杨AP2/ERF家族基因,根据其编码氨基酸序列的相似性和AP2/ERF结构域的数量可分为4类,分别为AP2、ERF、DREB和RAV亚家族及其他(Potri.002G246100)。利用生物信息学方法分析了毛果杨210条AP2/ERF蛋白序列的系统发生、基因组定位、氨基酸组成、理化性质及二级和三级结构等。研究结果可为杨树AP2/ERF家族基因的功能分析提供参考依据。     

两个苹果乙烯反应因子MdAP2D4与MdAP2D19的序列分析及原核表达

【目的】克隆苹果中的两个ERF（ethylene responsive factor）转录因子,对其序列与表达进行分析;并进一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,为解析两基因的抗病功能及作用机制奠定基础。【方法】首先,将抑制性消减杂交筛选到的EST序列进行BLAST比对,根据比对获得的MdAP2D4与MdAP2D19的cDNA序列设计引物进行克隆;然后,利用MEGA4.1软件将两个ERF蛋白与拟南芥的AP2家族蛋白进行聚类分析,对保守的AP2功能域的氨基酸序列进行分析;并进一步利用RT-PCR检测两基因对外源MeJA的响应;最后,将两个基因分别连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21进行诱导。【结果】MdAP2D4与MdAP2D19两个基因均与拟南芥B3组ERF亲缘关系最近,在叶片中表达较高,都能被外源的MeJA诱导表达。SDS-PAGE检测结果表明,两个基因的融合蛋白均能够被IPTG诱导表达。【结论】 MdAP2D4与MdAP2D19为 B3组ERF转录因子,外源MeJA能够诱导其表达。     

木榄ERF转录因子基因的克隆及功能分析初探

利用RACE-PCR技术,以深圳红树自然保护区的木榄为材料,克隆出一个ERF类转录因子基因的cDNA全长序列,命名为BgERF(GenBank序列号:GU593720)。生物信息学分析表明:该基因全长1 870 bp,完整开放阅读框1 425 bp,具有一个保守的AP2/EREBP结构域,且编码的由475个氨基酸组成的蛋白具有典型的1个α螺旋,3个β转角的三维结构,在AP2/EREBP结构域的第14位为丙氨酸(A),第19位为天冬氨酸(D),属于AP2/EREBPF蛋白家族中的ERF类转录因子;NCBI-BLAST比对结果表明:该基因与胡萝卜、拟南芥、水稻、辣椒、番茄、大豆、马铃薯、陆地棉等植物ERF类转录因子具有较高的同源性;并构建了高效植物表达载体PBI121-35s-BgERF,获得的转基因烟草与野生型相比,表现出明显的耐盐性,为该基因功能的深入分析和耐盐机理的研究奠定了基础。     

籼稻GAD基因的克隆、序列分析及其植物表达载体构建

[目的]克隆籼稻谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的全长cDNA,并进行序列分析和植物表达载体构建,为改良水稻的营养保健品质奠定基础.[方法]根据已知植物GAD基因的保守区域设计引物,以高GABA籼稻品系“新-9-4”的胚芽为材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆GAD基因的全长cDNA;扩增其编码序列,构建双T-DNA植物表达载体.[结果]扩增获得长1962 bp的籼稻GAD基因全长cDNA(OsiGAD),包含1479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.OsiGAD与已报道的水稻GAD基因OsGAD1、OsGAD2、OsGAD3的核苷酸序列同源性分别为67.1%、69.4%、98.3%,推导氨基酸序列的同源性分别为77.6%、70.1%、100.0%.OsiGAD蛋白序列具有磷酸吡哆醛结合位点和与钙调蛋白结合的C端延伸区域;构建了其具有水稻胚乳特异表达特性的双T-DNA植物高效表达载体pCDMAR-OsiGAD-hpt,选择标记基因和OsiGAD-因分别位于此载体的两个不同T-DNA区.[结论]克隆获得的籼稻GAD基因OsiGAD长1962 bp,并成功构建了其双T-DNA植物高效表达载体.     

蝴蝶兰MADS-Box基因克隆及植物表达载体的构建

【目的】克隆蝴蝶兰MADS-Box基因并构建其正义和反义植物表达载体,为其功能研究奠定基础。【方法】以蝴蝶兰杂交品种(Phalaenopsis hybrid cv.Jiuhbao Red Rose)为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术从花葶中克隆MADS-Box基因,并构建正义和反义植物表达载体。【结果】克隆获得一个蝴蝶兰MADS-Box基因,命名为DtpsMADS1(GeneBank登录号JQ065097)。该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp的5'非编码区、185 bp的3'非编码区和一个738 bp的编码区;该基因编码245个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该基因编码的蛋白质为碱性亲水性蛋白,具有62.45%的α-螺旋,8.16%的延伸链和29.39%的不规则折叠。序列比对和系统进化分析结果表明,DtpsMADS1与蝴蝶兰ORAP13的亲缘关系最近,同源性达99.0%,与石斛和蕙兰的同源性分别为83.0%和82.0%,属于MADS家族A类亚家族。将DtpsMADS1基因连接到植物表达载体pBI121上,构建获得正、反义植物表达载体pBI121-DtpsMADS1-S和pBI121-DtpsMADS1-A。【结论】成功克隆的蝴蝶兰DtpsMADS1基因属于MADS家族A类亚家族,具有明显的保守性和特异性,可为蝴蝶兰DtpsMADS1基因功能的鉴定及蝴蝶兰的遗传改良奠定基础。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of pseudomonas aeruginosa Lipase gene.[Method]Lipase gene was amplified by PCR from the genome DNA of pseudomonas aeruginosa,and its nucleotide sequence was determined.The prokaryotic expression vector of Lipase gene was constructed by the gene recombination technique.The protein expression was induced for 4 hours by IPTG with the final concentration of 1.0 mmol/L,and then SDS-PAGE electrophoresis was analyzed.[Result]The sequence of mature peptides in Lipase gene cloned from pseudomonas aeruginosa had a 99.36% homology with that of pseudomonas aeruginosa lipase submitted in NCBI,so the prokaryotic expression vector of Lipase gene pET32a-Lip was successfully constructed.Furthermore,the results of SDS-PAGE electrophoresis showed that the target gene was expressed highly and effectively.[Conclusion]The cloned pseudomonas aeruginosa lipase with its signal peptide could be normally expressed in E.coli and also used for further study.     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。     

苜蓿MtCDPK1基因序列分析、克隆及表达载体构建

[目的]克隆苜蓿MtCDPK1基因,对其进行序列分析,并构建其表达载体。[方法]根据MtCDPK1基因的全长序列设计引物来克隆该基因,并用生物信息学方法对该基因表达的蛋白序列进行分析,最后通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体。[结果]试验成功克隆到了MtCDPK1基因,并证明MtCDPK1蛋白属于Ca2+依赖的蛋白激酶,同时成功构建了该基因的表达载体。[结论]该研究为苜蓿的遗传转化提供了良好的基础。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建(英文)

[Objective] Genetic Engineering technology was used to regulate the expression of PttGA20-oxidase gene thus restrained plant height growth and internode elongation for cultivating dwarfed plant.[Method] Based on the RNAi principle,the gene specific sequences of PttGA20-oxidase in the antisense and sense orientations interrupted by a gene sequence from GUS were cloned into a binary vector pBI121.The selection marker gene npt Ⅱ was replaced with bar gene to RNAi plasmid.[Result] After undergone different endonuclease restrictions,the constructed constraint vector released different segments whose sizes were similar to that of target segment,which demonstrated that the RNAi plasmid of PttGA20-oxidase gene was successfully constructed.[Conclusion] The experiment provided a new way for culturing dwarfed plant.     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。