利用晚疫病菌无毒基因瞬时表达技术鉴定马铃薯抗病基因

由Phytophthora infestans引起的晚疫病是马铃薯的毁灭性病害。明确现有马铃薯品种或育种材料含有的晚疫病抗病基因,对于抗病育种和合理利用不同抗病基因防治马铃薯晚疫病具有重要意义。根据"基因对基因"学说,马铃薯无毒基因与抗病基因产物互作会产生典型过敏反应(HR)。理论上利用病原菌无毒基因可以鉴定马铃薯是否含有相应抗病基因。本研究尝试利用农杆菌注射技术,在马铃薯叶片中瞬时表达晚疫病菌无毒基因(Avr),根据过敏反应发生情况,进而推断马铃薯品种/育种材料所含相应抗病基因(R)。研究结果显示:适合马铃薯瞬时表达的农杆菌浓度为0.5(OD600),马铃薯材料农杆菌瞬时表达存在明显的基因型和叶龄依赖性,充分展开的幼嫩叶片适合农杆菌瞬时表达。Avr1,Avr2,Avr3a和Avr4在含有相应抗病基因的马铃薯鉴别寄主上瞬时表达能够产生HR,表明无毒基因注射鉴定结果是可靠的。无毒基因注射鉴定结果与抗病基因特异引物PCR扩增结果在不同基因型材料上有时并不一致,反映了这两种方法各有局限性,若能将这两种方法结合使用,则会提高鉴定结果的准确性。     

低磷胁迫柱花草差异表达基因分析研究

研究柱花草在低磷条件下生长的分子机理和反应机制。采用cDNA-SRAP分子标记技术分离柱花草茎和叶在低磷胁迫下相关基因的差异表达片段,并对其进行生物信息学分析。结果表明,8对引物组合共扩增出差异片段195条,其中抑制型表达片段56条,诱导型表达片段92条,上调表达型差异片段36条,下调表达型片段11条,大小均在50~1000 bp之间。二次扩增后将特异性条带回收后进行测序,通过BLAST比对,共比对出14条差异片段的同源序列,其中8个差异表达的核苷酸序列与已知功能基因（JCVI-FLLj-1K4未知mRNA、NBS-LRR型抗病蛋白、ATP合成酶、醛固酮还原酶、叶绿体RF2）有较高同源性,5个序列与假定基因或预测基因（UPF0051蛋白、蛋白酶启动子、SCEI结合酶、吲哚-3-丙酮酸盐单氧酶）同源性较高。本研究为筛选柱花草响应低磷胁迫的差异基因提供参考。     

DDRT-PCR技术分离枇杷幼果低温诱导相关基因

采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,分离枇杷‘早钟6号’幼果在0℃低温胁迫6h后差异表达的基因。共分离到19个差异表达的基因片段,经反向Northern杂交,得到了4个阳性的枇杷低温诱导相关基因片段(编号为CSIGE1～4-Cold Stress Induced Genes in Eriobotrya japonica1～4)。结果显示:CSIGE1只在低温处理的枇杷果实中表达,这表明该基因与低温逆境有关;CSIGE2和CSIGE3是受低温诱导的上调表达基因;而CSIGE4登录号为GT617706,未搜索到与任何基因有相似性,可能为新基因。     

稻瘟病菌株CH63和TH16杂交组合的遗传图谱构建及无毒基因定位

 测定了CH63和TH16杂交后代（F1代子囊孢子群体）在36个水稻品种上的致病性，依据F1代子囊孢子群体在不同品种上的无毒性/毒性表型和SSR、SCAR和RAPD等分子标记的多态性位点共分离构建了稻瘟病菌的遗传图谱。图谱共有151个标记位点，7个连锁群，全长1038.4 cM。由杂交后代在不同品种上的无毒性/毒性分离鉴定出CH63菌株持有多个无毒基因，在该遗传图谱中初步定位了Avr2 K59、Avr C105TTP1、Avr Zh156、Avr Xuan1641、Avr Xuan6392和Avr C103TTP 6个无毒基因，分别定位在第1、第4和第7染色体上。     

利用DDRT-PCR分析茶树冬季冷驯化过程中基因表达的差异

采用DDRT-PCR方法对茶树冬季冷驯化过程中3个样品基因差异表达进行初步研究。结果表明,抗寒性不同的茶树存在基因差异表达。从134条差异片段得到稳定扩增的差异片段31条。根据差异片段的序列设计引物对部分片段进行RT-PCR鉴定假阳性,得到10个阳性片段,其中6个表达量增加,4个表达量降低。经过BLAST比对分析,这些基因与多种植物基因同源性较高,如nectainⅢ蛋白基因(3)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶蛋白家族基因(48)、微管蛋白特异性C伴侣基因(52)、光合系统Ⅱ蛋白D1基因(80、138)、卵磷脂胆固醇酰基转移酶(147),15、82、134和葡萄的蛋白同源性较高。72经比对没有同源性序列。     

利用mRNA差别显示技术分离橡胶树死皮病相关cDNA

从中国热带农业科学院橡胶树早期预测试验地采集不同品系的橡胶树胶乳和树皮组织，分别提取纯化mRNA 合成cDNA第一链。通过4个简并锚定引物和10个随机引物进行PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了至少4个差异DNA片段只在健康树中表达而在死皮树中没有出现，这4个差异DNA片段分别命名为Hb1(725bp),Hb2,Hb3,Hb4。对Hb1进行了分离，纯化，经Northern杂交证实，Hb1在健康树胶乳中表达活跃，而在死皮树胶乳中表达受到强烈抑制，表明Hb1是与死皮病相关的cDNA片段，进一步将Hb1片段进行回收和克隆，并进行DNA序列分析，序列在GenBank中进行BLAST分析未发现相关同源片段，死皮病相关cDNA片段的获得，将分离全长死皮病相关基因，搞清该基因表达调控的机理提供条件，进而为从分子水平上阐明死皮病的致病机理打下了基础。     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。     

基于cDNA-AFLP技术分析半膜覆盖下玉米大喇叭口期基因差异表达

为了探讨半膜覆盖调控玉米生长的差异表达基因及分子机制,以‘浚单29’为材料,露地栽培作为对照,与半膜覆盖间隔种植,利用cDNA-AFLP技术,采用90对单引物筛选半膜覆盖下差异表达基因,并进行生物信息学分析。结果表明,利用90对单引物组合共扩增出2 298条差异片段,其中上调表达的有1 429条,占总条带数的45%;下调表达的有869条,占总条带数的23.7%;无差异表达的有877条,占总条带数的27.6%。选择重复扩增稳定的20条差异片段进行回收测序,经过Blast数据库对比和基因注释分析,再将所得的15条差异片段按功能分为细胞骨架相关基因(13.3%)、能量代谢相关基因(13.3%)、细胞挽救和防御相关基因(6.7%)、转录过程相关基因(40%)、胞内转运相关基因(6.7%)和未知功能基因(20%)6大类。分析其中一些重要的基因,如RPM1在逆境抗性中起作用,MYM锌指蛋白、BCAS2蛋白和EIF3B翻译起始因子都与调控转录翻译相关。通过c DNA-AFLP技术筛选了多个半膜覆盖下差异表达的基因,为揭示半膜覆盖影响玉米生长发育的分子机制提供了基础资料。     

巴西橡胶树HbRPS6-2基因的克隆与生物信息学分析

从巴西橡胶树甲基化过滤文库中筛选到一个与RPS6同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,利用RACE进行特异片段的5’和3’扩增,获得长度为1 327 bp的HbRPS6-2基因克隆。生物信息学分析表明,该基因包含483 bp的开放阅读框,5’非翻译区为357 bp,3’非翻译区为475 bp,编码161个氨基酸。在HbRPS6-2氨基酸序列中没有预测到信号肽和跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbRPS6-2在N端前18个氨基酸区域内有一个较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个RPS6系统进化分析发现,巴西橡胶树的RPS6-2基因与多杀性巴氏杆菌的RPS6基因亲缘关系最近,而与拟南芥和玉米等亲缘关系相对较远。     

低温胁迫下茶树基因表达的差异分析

利用cDNA-AFLP技术分析了茶树在低温胁迫下的基因表达差异。用16对引物(256个组合)对三个样品池进行了差异条带的筛选,结果表明,在冷胁迫不同处理时期相关基因表达存在显著差异,共获得了86个差异片段。在选择回收的10条差异表达cDNA片段中,经克隆测序,Blast序列同源性检索,显示其中片段1与一种低温和盐胁迫响应蛋白有77%的同源性,片段5与拟南芥冷诱导表达相关60 s ribosomal protein L7(RPL7B)有89%的同源性;片段8与一种逆境诱导蛋白(Stress-induced H1-Histone protein)有79%的同源性;片段9与干旱条件下的EST序列有着较高的同源性,其它6个片段在GenBank数据库中未找到相似序列,可能为新基因。     

干旱胁迫下小麦幼苗基因表达谱的cDNA AFLP分析

为了分离和识别小麦抗旱相关基因,给小麦抗旱节水育种提供依据,以既抗旱又具备高水分利用效率的新疆春小麦主栽品种新春6号为材料,采用cDNA-AFLP技术,分析了小麦在两叶一心期干旱胁迫条件下的诱导表达基因。通过253对引物组合的筛选,共得到748个干旱胁迫特异上调表达的转录衍生片段(TDF)。对其中22条片段进行克隆、测序、Blastx比对和功能分类分析的结果表明,有18个TDFs所推导的蛋白质序列与NCBI已有序列同源,功能涉及逆境胁迫反应、发育、信号转导、抗病蛋白、跨膜转运、能量代谢等方面;有4个TDFs在NCBI找到同源序列,但功能未知。     

植物抗病机制与信号传导研究进展

植物抗病分子机制与信号传导途径的研究一直是分子植物病理学关注的热点,近十年来,该领域的研究取得了显著进展。本文主要从植物抗病基因与病原菌无毒基因的分子克隆与结构分析、二者之间互作模型、SA信号传导途径与JA信号传导途径的研究等方面概述了植物抗病机制的研究进展。     

利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

应用cDNA-AFLP技术筛选炭疽菌（Colletotrichum sp.1）危害诱导茶树毛蟹品种（Camellia sinensis cv. Maoxie）的差异表达基因,为探究茶树抗炭疽菌的分子机制奠定基础。利用256对选择性扩增引物组合分析病菌接种后0 h和48 h的叶片cDNA,经筛选、测序和BLAST比对获得136条差异表达片段（TDFs）。同源基因功能分析结果表明,128条TDFs与Nr数据库已有基因同源,其功能以胁迫响应、生物调控与信号转导为主;其中51条TDFs与TPIA数据库中冷害、干旱、盐碱条件下的差异表达基因高度同源。进一步对27条TDFs进行qRT-PCR验证,结果显示,有24条TDFs的表达情况与cDNA-AFLP的结果一致,WRKY转录因子、乙烯响应转录因子、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相关基因的表达显著上调。本试验通过筛选获得差异表达的抗逆相关基因,为后续的基因功能研究奠定基础。     

特异茶树品种“紫娟”叶色转变的基因表达差异分析

利用cDNA-AFLP技术研究了特异茶树品种"紫娟"幼嫩叶片和成熟叶片的基因表达差异。从256对引物组合中获得59个差异表达带,其中在幼嫩叶片中获得26个上调片段,成熟叶片中获得33个上调片段。通过GenBank BLASTX比对分析,所获得的片段包括转录因子、代谢相关蛋白、信号蛋白以及一些假设蛋白、未知蛋白和没有比对的基因片段。利用RT-PCR对片段ZM4、ZM7、ZM12进行表达特性分析表明,ZM4、ZM7、ZM12均在成熟叶片中上调表达。这些研究结果将为深入研究理解"紫娟"茶树叶色转变的机理,以及相关基因克隆打下基础。     

中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株无毒基因的分离及功能鉴别

 白叶枯病菌与水稻间的互作符合基因对基因模式,不同小种中存在特异的avrBs3/pthA家族基因。对中国水稻白叶枯病菌小种C8菌株基因组DNA进行BamHⅠ酶切和Southern杂交,发现了其特有的约6.0 kb大小、含avrBs3/pthA家族基因的信号条带。经文库筛选、Southern杂交和限制性酶切分析,获得了C8小种avr/pthC8a基因。将该基因导入菲律宾小种6 的代表菌株PXO99A中,发现avr/pthC8a可使PXO99A丧失对水稻品种Asominori（携有成株期抗性基因Xa17）的毒性,暗示avr/pthC8a可能是与Xa17相应的无毒基因。序列分析发现,avr/pthC8a基因大小为3816 bp,编码1272个氨基酸,由102 bp编码的34个氨基酸重复单元在基因内的重复数为20.5个,其3′端的BamHⅠ酶切位点由GGATCC突变为AGATCC,其他特征均与avrBs3/pthA家族的成员相似,即C端存在1个亮氨酸拉链、3个核定位信号和1个酸性转录激活域。avr/pthC8a基因3′端的BamHⅠ酶切位点发生突变在avrBs3/pthA家族基因中鲜有报道。中国C8小种avr/pthC8a基因的发掘,为进一步了解水稻黄单胞菌毒性变异以及avrBs3/pthA家族基因的进化提供了理论依据。     

可可蔗糖磷酸合成酶基因家族进化及组织表达分析

在高等植物中,蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase,SPS）是蔗糖合成的限速酶。在多种植物中都发现了SPS基因,而可可中尚未见相关报道。通过分析可可基因组数据库,鉴定出4个SPS候选基因,依次命名为TcSPS1、TcSPS2、TcSPS3和TcSPS4。4个基因的编码区（CDS）长度在3 075~3 228 bp之间,外显子数目为12~14,预测蛋白的平均分子量为118.15 ku,等电点均小于7。进化分析结果表明SPS基因家族分成3个亚族;TcSPS1和TcSPS2属于ClassⅠ亚族,TcSPS3和TcSPS4分别属于ClassⅡ亚族和ClassⅢ亚族。实时荧光定量PCR分析结果表明,TcSPS1与TcSPS2在树皮和果实中高量表达,TcSPS3和TcSPS4主要在叶片中表达。伴随着叶片和花蕾生长发育,各TcSPS基因表达量均呈现出上升的趋势,表明其与主要光合产物--蔗糖的合成或再合成有密切联系,参与可可“源库”器官中光合产物分配。     

花生MADS-box 基因片段的克隆

MADS-box基因是一类调控植物生长发育的关键基因。在多序列比对的基础上设计兼并引物,成功地从栽培种花生JL24DNA中扩增得到了130bp的基因片段。序列比对结果表明,该片段与26个MADS-box基因表现高度的同源性（79％～84％）．这表明花生MADS-box片段克隆成功。