利用Sod同工酶和RAPD标记鉴定小麦-中间偃麦草双体异附加系

利用Sod同工酶标记和RAPD标记对DAL1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11等11个小麦-中间偃麦草双体异附加系进行了鉴定。通过Sod同工酶分析，将Sod-Agil基因定位于中间偃麦草第2部分同源群染色体上，同工酶标记Sod-1Rf=0．35为异附加系DAL1、3、5、6、8、9、10和11的特有生化际记。RAPD分析结果表明，引物OPF16是特异引物，为异附加系DAL4、5、9、10和11所共有。OPF16 560是DAL5、9、10、11的特异RAPD标记，OPF16 1200是DAL4的特异RAPD标记。综合鉴定结果表明：DAL1、3、5、6、8、9、1O和11等8个异附加系中附加的是中间偃麦草第2部分同源群的染色体。DAL5、9、10、11是同一种异附加系，附加的异源染色体属于八倍体中5所携带的中间偃麦草染色体组；DAL6和DAL8为同一种异附加系：DAL2和DAL4是不同的异附加系，DAL4中附加的是不同于中2、中5所携带的中间偃麦染色体组的另外一个染色体组的染色体。应用上述遗传标记．可以快速地鉴定异附加系DAL1、3、4、5、6、8、9、10、11。     

小麦-中间偃麦草异附加系Z4的外源染色质的分子标记

以中间偃麦草基因组DNA为探针对小麦中间偃麦草异附加系Z4进行基因组原位杂交分析，表明异附加系Z4附加的一对中间偃麦草染色体与普通小麦的一对染色体发生了相互易位。对中间偃麦草、Z4和普通小麦品种宛7107进行RAPD分析，在100条随机引物中，有两个引物S1053和S1068在Z4中能扩出中间偃麦草的特异带。在利用Z4进行小麦抗锈病育种时，可使用这两个标记进行辅助选择。     

小麦-中间偃麦草二体异代换系山农0095的选育及其鉴定

 利用小麦品种烟农15与中间偃麦草直接杂交，以烟农15为回交亲本对其杂种F1回交2次，再经自交3次，从BC2F4中选出种质系山农0095。利用形态学、细胞学、种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）、RAPD和GISH等方法对其进行鉴定。结果表明，山农0095平均株高78 cm，穗长17.3 cm，穗粒数74个，旗叶长36.3 cm，旗叶宽3.03 cm，茎秆粗壮，多花多实，繁茂性好；其根尖细胞染色体数目为2n＝42，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ(PMC MⅠ)染色体构型为2ｎ=21Ⅱ；它与烟农15的杂种Ｆ1 在减数分裂中期Ⅰ的大多数花粉母细胞能观察到2个单价体，平均染色体构型为2ｎ=20.08Ⅱ＋1.84Ⅰ。A－PAGE鉴定结果表明，山农0095在β区出现一条中间偃麦草的特异带；从180个RAPD引物中筛选出一个特异引物S186（5?－GAT ACC TCGG－3?），能够在山农0095中扩增出一条约900 bp中间偃麦草的特异带，标记为S186900；以中间偃麦草基因组DNA为标记探针、中国春基因组DNA为封阻的原位杂交结果进一步表明，山农0095的42条染色体中含有2条完整的中间偃麦草染色体，是小麦－中间偃麦草的二体异代换系。     

小麦抗叶锈基因Lr38的一个新标记

【目的】建立小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38特异的PCR标记。【方法】以Thatcher为对照,以TcLr38和TcLr38×Thatcher F2代单株构建的分离群体为材料,利用TcLr38远缘亲本中间偃麦草特异的SCAR标记引物进行PCR扩增获得单一条带,并以50个小麦抗叶锈近等基因系材料对该标记特异性进行检测,Mapmaker 3.0软件计算该标记与Lr38的遗传连锁距离。【结果】中间偃麦草特异的SCAR标记引物在TcLr38中获得单一扩增片段大小为982 bp,50个小麦抗叶锈近等基因系检测表明为TcLr38的特有条带,F2代分离群体验证表明为与Lr38共分离的分子标记,命名为Y38SCAR982。【结论】Y38SCAR982可以作为Lr38的分子标记,并证实该基因由中间偃麦草向普通小麦转移的事实。     

小偃麦异附加系的细胞学及分子标记鉴定

利用形态学、细胞学、A—PAGE和RAPD方法，对5个小麦-中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)双体异附加系Line5、Line6、Line11、Line12和Line13进行了鉴定。细胞学鉴定结果表明，它们根尖细胞染色体数目为2n=44，花粉母细胞减数分裂中期I(PMC MⅠ)染色体构型为2n=22Ⅱ，具有高度的细胞学稳定性；形态学鉴定和A—PAGE电泳分析证明，Line12和Line13可能附加了中间偃麦草第2部分同源群的染色体，Line5和Line6可能附加了中间偃麦草第1部分同源群的染色体；RAPD分析表明，在供试的80个随机引物中，有2个引物S20和S21能够在亲本中间偃麦草和双体异附加系中稳定扩增出特异带型，并可作为异附加系所附加染色体的特异RAPD标记。     

偃麦草基因组特异重复序列的分离与应用

【目的】偃麦草(Thinopyrum)是小麦(Triticum aestivum L.)的多年生野生近缘植物,具有许多可用于小麦品种改良的优异基因。利用基因组特异重复序列可以研究物种的进化关系、绘制染色体指纹图谱及检测外源染色质。克隆十倍体长穗偃麦草(Th.ponticum(Host)Liu and Wang)基因组特异重复序列,可用于鉴定和追踪导入到小麦背景中的偃麦草遗传物质。【方法】通过构建十倍体长穗偃麦草小片段质粒文库,并对文库进行高密度点杂交(Dot-blot hybridization)筛选,结合荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术,获得偃麦草基因组特异的重复序列,分析其在不同基因组及染色体上的分布特点。利用Repeat Masker在小麦族重复序列数据库(Triticeae repeat sequence database,TREP)及NCBI Gen Bank对特异重复序列进行比对分析,并设计偃麦草基因组特异重复序列的PCR引物。通过FISH分析和特异PCR引物扩增,对小麦-偃麦草衍生后代进行鉴定和选择。【结果】获得7条偃麦草基因组特异的重复序列。FISH分析表明,其在十倍体长穗偃麦草和六倍体中间偃麦草所有染色体两臂上均呈弥散型分布,且在不加小麦封阻DNA的情况下,能明确区分八倍体小偃麦中的偃麦草和小麦染色体。将其应用到小麦-偃麦草代换系和易位系的分子细胞学检测中,特异重复序列同样可以在不加封阻的情况下分辨出偃麦草染色体及染色体片段,而且信号相比基因组原位杂交(genomic in situ hybridization,GISH)更加特异和清晰。基于偃麦草基因组特异重复序列开发了90对引物,通过在中国春、十倍体长穗偃麦草和八倍体小偃麦中的扩增产物比较分析,筛选出36对(40%)偃麦草基因组特异PCR标记;利用这些特异引物对109份小麦-偃麦草衍生材料进行扫描,发现10对扩增效果较好的特异引物,其检测效率为73.3%—95%。【结论】获得偃麦草基因组特异的重复序列,开发了特异PCR扩增引物,可应用于小麦背景下偃麦草遗传物质的高效检测和跟踪。     

普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种抗赤霉病基因的分子鉴别

【目的】赤霉病(Fusarium head blight,FHB)是世界范围内严重危害小麦生产的病害之一。十倍体长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum)具有优良的赤霉病抗性,普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种西农509、西农511和西农529在田间展现出较强的赤霉病抗性。本文旨在对这3个品种的赤霉病抗性基因进行分子鉴别,为它们在小麦赤霉病抗性遗传改良中的应用提供理论依据。【方法】通过赤霉病菌(Fusarium graminearum)人工接种鉴定,明确3个小麦新品种对赤霉病的抗性水平。利用偃麦草E组染色体(臂)第1—7同源群的特异引物对3个普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种及其主要亲本小偃693、小偃597和十倍体长穗偃麦草进行分子鉴定,确定其长穗偃麦草的遗传区段。利用与长穗偃麦草7EL染色体上抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁的标记对实验材料进行分析,明确该抗性基因与Fhb7的关系。【结果】鉴定结果表明,西农509、西农529和西农511的赤霉病抗性与中抗对照品种扬麦158的抗性水平相当,表现为中抗。105个长穗偃麦草E基因组特异标记中有7个在3个新品种中均能扩增出长穗偃麦草的特异条带,其中5个标记定位于7EL染色体臂上,2个标记定位于7ES染色体臂上。利用97个定位于7E染色体的特异标记进一步对小偃693、小偃597和3个新品种的遗传片段进行鉴别,结果表明20个标记能在5个长穗偃麦草衍生品种(系)扩增出稳定的十倍体长穗偃麦草的特异条带,其中包括与Fhb7紧密连锁的Xsdau K8、Xsdau K144、Xsdau K27、Xsdau K99、Xcfa2040和Xsdau K116等6个标记(7EL 149.00—7EL 153.77),即表明该区段源自于十倍体长穗偃麦草,跨距约89 c M。然而,已报道的7EL染色体臂末端与Fhb7两侧紧密连锁的分子标记Xsdau K60(7EL 153.77)、Xmag1932(7EL 154.70)、Xcfa2240(7EL 156.27)、Xsdau K66(7EL 158.02)、Xsdau K71(7EL 158.97)和Xsews19(7EL 160.00)等在3个新品种及小偃597中均没检出长穗偃麦草的特异条带。【结论】普通小麦-十倍体长穗偃麦草衍生新品种西农509、西农511和西农529具有较好的赤霉病抗性,携带来自于十倍体长穗偃麦草7E染色体的遗传区段,然而该抗赤霉病基因不同于Fhb7。     

小麦-中间偃麦草代换系CH188分子细胞学鉴定

中间偃麦草在小麦遗传改良中具有重要的作用。通过对小麦-中间偃麦草代换系CH188进行农艺性状、细胞学和分子标记技术鉴定,以确定其优良农艺性状及导入小麦基因组中的外源染色体。结果表明,CH188平均穗长14.60 cm,株高70.60 cm,小穗数、千粒质量等优于主栽品种;根尖细胞的有丝分裂中期染色体数目为2n=42;基于中间偃麦草第6同源群Contig序列开发了160个STS标记,其中,8个可作为识别小麦-中间偃麦草代换系CH188中6St染色体特异标记,可以推测小麦-中间偃麦草代换系CH188是小麦的一对染色体被中间偃麦草6St染色体替代;其优良的农艺性状可能来源于中间偃麦草6St染色体。CH188具有优良的农艺性状,可能是一个小麦-中间偃麦草代换系。     

应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质

利用生物素（biotin-16-dUTP）标记的中间偃麦草（Thinopyrum intermedium）基因组DNA作探针,以未标记的普通小麦中国春基因组DNA作封阻DNA（blocking DNA）,对3个抗黄矮病小麦新种质的体细胞染色体进行分子原位杂交。结果表明：抗性源于L1的抗黄矮病小麦新种质Yw642为小片段易位系,含40条小麦染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体,易位的中间偃麦草染色体片段位于小麦染色体的端部;染色体配对和抗性分析表明该种质为纯合易位系。抗性源于无芒中4的小麦新种质Hw240和Yw060遗传构成不同：Yw060为易位系,含40条小麦染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体;Hw240为代换易位系,含38条小麦染色体、2条中间偃麦草染色体和2条小麦-中间偃麦草易位染色体。在这2个种质中,易位的中间偃麦草染色体片段均位于小麦染色体端部。     

基于RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用

【目的】百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum Löve, 2n = 2x = 14, JJ或E^bE^b）是小麦改良的重要亲缘物种,开发染色体特异分子标记对于加快其有利基因向小麦中的转移和应用有重要意义。【方法】利用百萨偃麦草分蘖期叶片RNA-seq获得的EST序列与节节麦D基因组序列进行比对,鉴定出4 957条没有相似性的序列作为筛选百萨偃麦草特异序列的基础序列。从这些基础序列中随机选择部分序列设计EST-PCR引物507对,通过在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析,筛选出百萨偃麦草基因组特异标记,然后在已经选育出的8个小麦-百萨偃麦草异染色体系中进行染色体定位,并探讨这些标记在小麦染色体工程中的应用潜力;根据谷类作物的共线性,以百萨偃麦草EST序列设计共线性引物100对,并比较这些引物的扩增和定位结果。【结果】在开发的507对引物中,204对（40.2%）在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中具有特异扩增,多态率远高于利用小麦（12%）和百萨偃麦草（14%）EST设计的234对共线性引物产生的多态率,建立了高效开发小麦亲缘物种特异标记的新方法;利用8个中国春-百萨偃麦草异染色体系,共定位了198个百萨偃麦草特异标记,分别位于染色体1J（31）、2JS（15）、2JL（26）、3JS（20）、4JS（12）、4JL（12）、5J（27）、6JS（13）、6JL（22）和7JS（20）,其中189个是根据百萨偃麦草转录组序列设计;利用定位于1J和6J的特异标记确定了4个易位系的染色体身份,其中1个涉及1J的大片段易位,2个涉及6JS的不同区段易位,1个为小片段中间插入易位;利用这些易位系,将30个1J和12个6J特异标记分别定位于2个物理区段。【结论】通过RNA-seq结合与小麦基因组序列比对可以获得小麦亲缘物种相对特异的EST序列并据此开发引物,建立了开发外源染色体特异标记的新方法,开发的标记可应用于小麦异易位系鉴定和缺失物理图谱的绘制。     

葡萄无核基因的SCAR标记及Southern blot分析

根据无核基因特异RAPD标记的序列进行分析,合成1对特异引物P1+P3(序列分别是P1:5′CTCATCTTCTTGATGGTGAT3′;P3:5′AAGTGAAGAACATCATTAAGAAC3′),对30个葡萄材料进行PCR扩增,成功地将RAPD标记转换成SCAR标记。并对含有该标记序列的重组质粒进行Hind 和Spe 双酶切,获得的310bp片段回收后制成探测葡萄无核基因存在与否的杂交探针,成功地对7个葡萄品种进行Southernblot分析,实现了分子标记检测葡萄无核基因的目的。     

大白菜杂交种“冠春”特异性SCAR标记的获得及其验证

以获得的春大白菜品种"冠春"的特异性RAPD标记为依据,通过对8个特异片段的回收,克隆测序,采用引物延长法设计了SCAR引物,经过双亲及其杂交一代的鉴定,6个SCAR引物多态性消失,2个SCAR引物扩增出了单一的特异条带,而且SCAR标记的差异与原始的RAPD特异性标记的差异完全相同,为大白菜杂交种"冠春"的品种鉴定和品种保护提供了技术依据。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

核桃早实基因的RAPD标记及其序列分析研究

 【目的】确定RAPD标记OPB-08900与核桃早实基因的遗传距离，对该标记测序，分析其序列特征。【方法】以核桃早实优系绿园和晚实、速生优系绿丰及绿园×绿丰杂交组合的154株F1杂种后代材料的DNA为模版，OPB-08（5′-GTCCACACGG-3′）为引物，PRAD-PCR技术检测与核桃早实基因相关的RAPD标记OPB-08900在供试亲本和F1群体的分离状况，Haldane函数计算遗传距离；对OPB-08900 DAN片段克隆测序；DNAMAN软件分析序列酶切位点，BLAST分析序列同源性。【结果】RAPD标记OPB-08900在早实亲本绿园上标记带出现，在70株早实后代的69株上出现；但在晚实亲本绿丰上该标记带未出现，在84株晚实后代中有82株未出现；供试杂交群体早实和晚实性状的分离比例符合1﹕1的分离比例，RAPD标记OPB-08900与核桃早实基因共分离，OPB-08900与核桃早实基因的遗传距离为1.99 cM，序列全长958 bp，该标记应记为OPB-08958，GenBank序列号为DQ673614；有36个限制性内切酶对OPB-08958序列有97个酶切位点， OPB-08958序列和植物基因组序列没有同源性。【结论】核桃的早实性状受多基因控制，RAPD标记OPB-08958与核桃早实基因之一相连锁，其DNA序列为核桃基因组所独有。     

采用ISSR方法研究簇毛麦属与偃麦草属染色体组的遗传关系

[目的]确证簇毛麦属（Dasypyrum）与偃麦草属（Thinopyrum）物种不同基因组的系统发生关系。[方法]采用ISSR引物对12个小麦族物种扩增后进行了聚类分析。[结果]多年生簇毛麦（D.breviaristatum）、中间偃麦草（Th.intermedium）和二倍体长穗偃麦草（Lo-phopyrum elongatum）亲缘关系最近而聚在一起,而二倍体簇毛麦（D.villosum）与拟鹅观草（Pseduoroengeria spicata）聚在一起。[结论]多年生簇毛麦Vb基因组与偃麦草E基因组关系较近;二倍体簇毛麦和多年生簇毛麦未聚在一起,支持＂多年生簇毛麦不是二倍体簇毛麦加倍产生＂的观点。关键词簇毛麦属;偃麦草属;ISSR;聚类分析;遗传进化 更多还原     

辣椒胞质雄性不育基因的分子标记

利用近等基因系原理和RAPD标记技术对辣椒胞质雄性不育基因组DNA及其保持系基因组DNA进行了比较分析,通过200条随机引物的RAPD扩增,获得了与不育基因连锁的RAPD标记BH19-S900。测序结果表明,不育标记BH19-S900序列全长864 bp。根据RAPD标记序列分别设计并合成双引物,将与不育基因连锁的标记BH19-S900转化为更为简单、稳定的SCAR标记SS730。     

小麦条锈菌条中29号生理小种SCAR检测标记的建立

用210条随机引物对中国小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)5个主要生理小种进行了RAPD分析,寻找到了2个条中29号特异性的RAPD标记。根据其中一个特异片段的测序结果,设计了特异PCR引物,成功获得了条中29号小种专化的SCAR标记。     

燕麦D基因组特异标记开发

为了提高燕麦分子育种的效率,旨在开发燕麦D基因组特异分子标记。先利用300 条10 碱基随机引物对9 种燕麦种材料进行随机多态性扩增(random amplified polymorphic DNA,RAPD),扩增出燕麦D基因组特异性条带,命名为OPAB011287,经Blast 比对后发现该条带为一反转座子重复序列,根据此条带序列设计特异性引物,建立更简便稳定的SCAR标记。结果发现该SCAR标记可以准确特异的检测到9 种试验材料中含有D基因组的燕麦品种,结论表明该标记可用于燕麦分子标记辅助育种,有效服务于燕麦优良品种培育。