几丁质酶基因在球孢白僵菌中的超表达提高其对马尾松毛虫的毒力

几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁的过程中起一定作用,但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究通过几丁质酶基因在球孢白僵菌Beauveria bassiana中的超表达以及超表达菌株的毒力变化研究了该基因与毒力的关系。将几丁质酶基因Bbchit1通过芽生孢子转入野生型球孢白僵菌中,获得多拷贝的转化子;转化菌株在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于出发株4.2倍,表明该几丁质酶基因在转化菌株中得到超表达。毒力测定发现转化子对马尾松毛虫Dendrolimus punctatus的致死中浓度比出发株降低84.5%,在2.5×107孢子/ml浓度下的致死中量减少84.5%,致死中时缩短0.7d,因此毒力大大提高。第2~9d感病死虫数与转化子第1~8d酶活呈极显著正相关（P〈0.01）,而与出发株不相关（P〉0.05）。这些证据表明,几丁质酶与毒力的关系是复杂的,在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。     

球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析

为明确球孢白僵菌的各项生物学指标与其对小菜蛾致病力间的相关性,对一株球孢白僵菌菌株GXU-Bb进行单孢分离,测定了菌株GXU-Bb及其分离子菌株GXU-Bb16、GXU-Bb10、GXU-Bb13和GXU-Bb05这5个菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率、胞外蛋白酶水平和几丁质酶水平等多项生物学指标。结果表明,各菌株间生长速率和孢子萌发率无显著差异;产孢量变化范围1.54×10^7-2.98×10^7个/ml;胞外蛋白酶水平变化范围1.04-1.19;几丁质酶水平变化范围1.05-1.14;各菌株间对小菜蛾二龄幼虫的致病力差异较大,校正死亡率变化范围为39.81%-83.79%。将各生物学指标与菌株对小菜蛾二龄幼虫的校正死亡率进行回归分析得出,球孢白僵菌对小菜蛾的致病力与菌株生长速率、孢子萌发率无显著相关关系;与产孢量、胞外蛋白酶水平呈极显著正相关关系;与几丁质酶水平呈显著正相关关系。     

一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分离及鉴定

从柑橘木虱虫体分离得到一株具有强致病性的虫生真菌GZMS-28,本文测定了该菌株对柑橘木虱的致病性,并分析了其rDNA ITS基因序列。试验结果表明,该菌株对柑橘木虱具有较强的致病性,浓度为1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液处理柑橘木虱成虫7d后,其校正死亡率达到95.7%。菌株GZMS-28的培养特征与白僵菌属球孢白僵菌较为一致,其rDNA ITS序列与GenBank中白僵菌属多个球孢白僵菌菌株的对应序列相似性达到99%以上,因此将菌株GZMS-28鉴定为球孢白僵菌Beauveria bassiana。     

五株病原真菌对桃小食心虫的致病力

为筛选桃小食心虫高致病性菌株,以在山西省自然感病的桃小食心虫越冬幼虫上分离获得的5株病原真菌为材料,研究各菌株感染桃小食心虫幼虫的症状、对寄主的致死率,以及与菌株毒力相关的胞外类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的活性变化,并评价其生物防治潜力。5个菌株在寄主上的感病症状和致死率有显著差异,感病后10天,球孢白僵菌BbTST05对寄主的致死率最高,为89.3%,其类枯草杆菌蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶3种酶活性均最大;粉棒束孢IfTSL02对寄主的致死率及其蛋白酶、几丁质酶活性次之;尖孢镰孢菌的FoTSL01、FoTSL03和FoTSL04菌株对桃小食心虫的致死率均低于61%,3种胞外酶的活性也较低。因此,球孢白僵菌BbTST05和粉棒束孢IfTSL02可用于桃小食心虫的防治。     

球孢白僵菌诱导酶发酵液对其毒力的增效作用

为进一步确认含蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶的诱导酶发酵液对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌株毒力的影响,将高毒力菌株B5、Bxs与低毒力菌株B11、BZ分别制成1×107个/mL孢悬液(I型)、孢悬液+诱导酶发酵液(V∶V=1∶1;II型)、孢悬液+灭菌诱导酶发酵液(V∶V=1∶1;III型),用浸渍法分别测定I型、II型与III型3种液体对松墨天牛(Monochamus alternatus)幼虫的毒力。结果表明:分别含有蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的诱导酶发酵液Ⅱ型液体,其LT50值与Ⅲ型液体LT50间的差异均为极显著(P0.01),而含淀粉酶的差异不显著。分别含有4种酶的诱导酶发酵液的Ⅲ型与Ⅰ型液体相比,LT50值之间也存在极显著差异(P0.01)。可见:含蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的诱导酶发酵液对球孢白僵菌毒力具有极显著的增效作用;经过酶灭活的4种诱导酶发酵液增效作用也极显著。     

N~＋注入选育高毒力球孢白僵菌菌株及对3种油茶害虫的毒力测定

以低能氮离子注入（N＋）作为诱变手段对球孢白僵菌进行诱变,并对3种油茶主要害虫进行了毒力测试。结果表明：不同剂量的氮离子注入后白僵菌存活率呈＂马鞍曲线＂,其峰值即150×1013ions.cm-2为诱变最佳剂量。氮离子注入对白僵菌的菌落形态、产孢量、孢子萌发率等生长特性均有影响,通过产孢量、Pr1蛋白酶活和几丁质酶活指标筛选我们得到3株优良菌株,其中BbⅢ22菌株的Pr1蛋白酶活和几丁质酶活分别达0.230、0.137（OD值）,为出发菌株的近2倍水平。BbⅢ22菌株对油茶叶蜂、油茶毒蛾有较强的致病力,在孢子浓度为107孢子.mL-1时,致死率达到了80%以上,而对油茶象甲的致死率相对较弱为60%左右。对油茶叶蜂、油茶毒蛾和油茶象甲的LD50对数浓度分别为5.2960、5.6347、6.3555。     

球孢白僵菌定殖提高番茄对灰霉病抗性及其作用机理

为明确球孢白僵菌Beauveria bassiana定殖对番茄植株抗病性的影响及作用机理,采用灌根法将球孢白僵菌芽生孢子悬浮液接种于番茄植株内,并通过人工接种灰霉菌Botrytis cinerea评价球孢白僵菌定殖后番茄对灰霉病的抗性水平;检测灰霉菌胁迫下番茄植株不同位置叶片内球孢白僵菌的相对含量;测定番茄叶片内草酸氧化酶（oxalate oxidase,OXO）、几丁质酶（chitinase,CHI）和ATP合成酶（ATP synthase,atpA）3种抗病相关基因的表达量。结果表明,球孢白僵菌定殖能够提高番茄植株对灰霉病的抗性,接种灰霉菌第5天,番茄植株发病率、病斑直径和病情指数分别下降了61.6%、41.4%和26.4%;在灰霉菌胁迫下番茄植株内球孢白僵菌偏好于在病原菌感染位置定向聚集,并且引起植物抗病基因OXO、CHI和atpA的表达量上调。表明球孢白僵菌能通过内生定殖与植物互作提高植物抗病性,在植物病害生物防治领域有较大应用潜力。     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因分析

本文研究球孢白僵菌对小菜蛾的侵染相关基因,为提高球孢白僵菌的致病力提供基因靶点,从而提高球孢白僵菌对小菜蛾的防治效果。通过室内生物测定,筛选出球孢白僵菌对小菜蛾的高毒力菌株;采用新一代Solexa高通量测序技术对纯培养的球孢白僵菌和球孢白僵菌侵染小菜蛾48 h的虫菌混合样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学方法分析差异表达基因涉及的基因功能及细胞通路等;应用荧光定量PCR技术验证20个基因的差异表达。转录组测序结果显示,纯培养的球孢白僵菌与侵染小菜蛾幼虫48 h的球孢白僵菌转录组对比分析共得到8383个差异表达基因,其中显著差异表达基因716个,上调基因350个,下调基因366个。本研究筛选获得的差异表达基因,特别是上调表达的基因可能与球孢白僵菌对小菜蛾的侵染有关。GO二级分类表明,DEGs被注释到26个GO term中,包括11个生物学过程,8个细胞组分和7个分子功能;Pathway分析表明共有12个Pathway,93个上调基因和61个下调基因参与了这些途径。深入分析发现,胞外丝氨酸富集蛋白、细胞壁蛋白、胞外双加氧酶、铁转运蛋白、细胞壁半乳糖抗原蛋白等在侵染过程中与毒力相关的基因均具有显著性差异表达。研究结果为阐明球孢白僵菌对小菜蛾的侵染机制提供了基础。     

西双版纳自然保护区球孢白僵菌的遗传多样性

为了解西双版纳自然保护区球孢白僵菌Beauveria bassiana的遗传多样性,采用SSR分子标记技术对西双版纳自然保护区的240株球孢白僵菌的遗传结构、基因流、菌株分化以及遗传变异相关性进行了测定和分析。结果表明,9条引物扩增240株球孢白僵菌菌株多态位点数为77个,多态位点比率为97.40%。采集的240株球孢白僵菌的总体等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为1.97、1.31、0.18和0.29。从寄主居群来看,鞘翅目昆虫球孢白僵菌群体遗传多样性最高,螳螂目最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为0.20和0.30、0和0;总遗传变异的29.27%存在于寄主居群间。从生境水平来看,五十五生境中球孢白僵菌群体遗传多样性最高,丫口寨生境中最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数最高分别为0.19和0.31、0.06和0.09;总遗传变异的14.92%存在于生境居群间。从季节水平来看,球孢白僵菌秋季居群的遗传多样性最高,夏季最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为0.20和0.32、0.17和0.26;总遗传变异的3.45%存在于季节居群间。表明西双版纳自然保护区球孢白僵菌在寄主昆虫、生境分布和季节间存在明显的遗传多样性,与寄主昆虫类群的关系密切。     

白僵菌的致病力与菌株生长特性及几丁质酶活性的关系

将辽宁、河南、山东等地采集到的70个寄生于桃小食心虫的球孢白僵菌菌株以3龄桃小食心虫进行筛选,得到了46-1,46-2和37-3三个致病率分别为96.7％、92.8％和93.3％的优良菌株。以四个代表高,中、低致病率的菌株46-1、46-2、7-1(43.3％)和66(33.3％),测定其菌丝的生长量,产孢量和几丁质酶活性的结果显示菌株的致病力与菌丝生长量、几丁质酶活性、菌株产孢量呈显著的正相关。     

寄生沙棘木蠹蛾的白僵菌菌株特性及其胞外蛋白酶、几丁质酶的活性

［目的］ 明确寄生沙棘木蠹蛾的白僵菌不同菌株的生物学特性,以筛选优良菌种加以利用。［方法］ 测定温湿度对分离自沙棘木蠹蛾幼虫和蛹的5株白僵菌菌株分生孢子萌发的影响,并采用平板测定法和Lowry及DNS测定法对白僵菌各菌株胞外蛋白酶和几丁质酶活性进行测定。［结果］ 白僵菌SJ 01、SJ 02、SJ 03、SJ 04、SJ 05菌株在15～35 ℃范围内均可萌发,15、20 ℃和35 ℃时孢子萌发率相对较低,25 ℃时5株菌株萌发率均高,为90％～98％。相对湿度为41％、50％和61％时,各菌株均不萌发;76％和80％时,SJ 05的萌发率明显高于其他菌株,分别达60％和80％。50 ℃高温胁迫24 min和30 min后,各菌株萌发率均显著降低,几乎不萌发。胁迫12 min和18 min后,SJ 05的萌发率较其他菌株高,表明其抗高温性强。5株菌株均可产生胞外蛋白酶和几丁质酶,其中SJ 05菌株胞外蛋白酶产量为55.3 U/mL,几丁质酶产量为137.9 U/mL,其蛋白酶和几丁质酶活性均显著高于其他菌株。［结论］ SJ 05菌株具有较强的耐热性,一定的抗低湿能力,较高的蛋白酶和几丁质酶活性,为最优菌株。     

2013年我国黏虫发生特点分析

2013年黏虫维持了2012年以来的重发态势。二代黏虫在东北、华北、黄淮局部、江南局部、西南地区普遍发生,多种作物受害严重,总体发生程度重于2012年同期,山西、河北等局部地区大发生。三代黏虫在东北、华北和黄淮局部等地偏重发生,虽然发生面积、发生程度整体上不如2012年严重,但是仍显著重于常年,并且在辽宁、山西、山东的局部地区造成严重危害。分析提出,监测防控及时到位、关键时期气象条件不利,是2013年三代黏虫发生程度轻于2012年的主要原因。     

拟康宁木霉T 51几丁质酶活性及内切几丁质酶基因克隆与分析

木霉是一类重要的生防真菌,木霉产生的几丁质酶在其生物防治的重寄生过程中起着重要作用。拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis T-51是一株对番茄灰霉病有生防潜力的木霉菌株,本文测定了T-51菌株产生几丁质酶的活性,结果表明T-51在PDB中液体培养以及与灰霉病菌在PDA上对峙培养时产生的几丁质酶活性显著受到灰霉病菌的诱导。采用RACE技术首次克隆了拟康宁木霉T-51中一个几丁质酶基因Tkchit42,全长为1 817bp,包含4个外显子和3个内含子。预测该基因有一个1 275bp的开放阅读框,编码424个氨基酸,预测的蛋白总分子量为46.378kDa,预测的等电点(pI)为5.16,与T.koningii中42kDa内切几丁质酶的氨基酸序列相似性达到99%。     

烟草拮抗链霉菌FT05W基因组测序与几丁质酶家族基因鉴定

链霉菌FT05W是一株对烟草黑胫病等土传真菌病害具有良好拮抗作用的生防放线菌。本研究利用Miseq PE300高通量测序平台对链霉菌FT05W基因组进行序列测定，共获得6914188个reads，通过SPAdes软件对序列进行拼接共得1836个contigs，其基因组全长为7699129 bp，GC比为71%，其中编码基因序列长度为6037181 bp，预测出7434个蛋白编码基因（GenBank登录号：NZ_QGMR00000000），预测编码7323个蛋白。获得的基因注释信息为今后深入开展其在烟草上的生物防治机理研究奠定了重要的基础，有助于推动烟草生防链霉菌功能基因的挖掘与利用，为烟草生防链霉菌FT05W的进一步开发与应用提供理论依据。利用MEGA 6.06构建链霉菌FT05W的几丁质酶家族基因系统发育树，共鉴定出7个几丁质酶家族基因，其中6个为18家族几丁质酶基因，1个为19家族基因。     

白僵菌培养基继代培养对蛋白酶（cdep1）、几丁质酶（chit1）基因表达的影响

[目的]对球孢白僵菌D6-2和L1-1菌株进行室内培养基继代培养,比较其不同世代之间毒力及毒力相关基因表达之间的差异.[方法]对目的菌株进行室内生物测定,用LT50和LT90作为毒力评价标准来检测不同世代之间毒力的变化情况.为了明确继代培养对球孢白僵菌毒力相关酶基因表达情况的影响,以18S rDNA基因为内参,利用半定量RT-PCR对蛋白酶cdep1基因和几丁质酶chit1基因的表达情况进行检测.[结果]在107孢子/mL供试浓度下,随着世代的更替,两个供试菌株F2代相比于F1代,其LT50和LT90降低,说明其对玉米螟的毒力有所增强.而两个供试菌株F2～F5代对玉米螟的毒力呈下降趋势.在内参基因稳定表达的情况下,两个供试菌株L1-1和D62的cdep1基因和chit1基因在F1和F2代表达稳定,随着继代次数的增多,供试菌株两个基因的表达量均呈下降趋势,这与对亚洲玉米螟毒力测试的结果呈正相关性.[结论]F2代毒力和毒力酶基因表达最强,F1代与F2代基本相似或略低于F2代,F2～F5代毒力和毒力酶基因表达依次减弱.     

球孢白僵菌菌丝生长中HsbA基因的表达量变化

球孢白僵菌是一种具有杀虫潜力的生防真菌,菌丝是其重要的结构单位,而疏水蛋白被认为参与了气生菌丝的生长过程。本文以球孢白僵菌疏水表面结合蛋白编码基因HsbA为检测对象,利用荧光定量PCR方法研究了该基因在液生菌丝和气生菌丝中的相对表达量,结果表明,HsbA基因在气生菌丝中的相对表达量显著高于液生菌丝。基于以上结果,我们推断,HsbA基因在气生环境下的上调表达可能会增加其编码蛋白的总量,从而对球孢白僵菌气生菌丝的生长发育起到调控作用。研究结果不仅为菌种的遗传改良提供了一个切入点,也对菌株的商业化生产有一定的指导意义。     

七种化学杀虫剂与球孢白僵菌TST05菌株的相容性研究

本文测定了7种常用化学杀虫剂高效氯氰菊酯、高氯甲维盐、辛硫磷、高效氯氟氰菊酯、阿维菌素、阿维杀虫单、虫酰肼对球孢白僵菌TST05菌株菌丝生长及孢子萌发、生长及产孢的影响,以研究化学药剂与球孢白僵菌TST05菌株的相容性,为化学杀虫剂和白僵菌制剂混合应用提供依据.结果表明,在田间常用浓度下,7种杀虫剂对该菌株的菌丝生长抑制率为27.93％～38.74％.虫酰肼组的孢子萌发率为33.19％,几乎不形成菌落,产孢量仅为0.05×106个/mL;而其余6种杀虫剂组的孢子萌发率为50.34％～70.62％,能形成较致密的菌落,产孢量为(2.51～3.58)×106个/mL.杀虫剂对该菌株的抑制作用随着浓度的降低而减小,田间浓度再稀释5倍后,各处理组孢子萌发率升高到72.08％～84.92％;产孢量为(3.01～9.61)×106个/mL.在田间浓度下,虫酰肼与该菌株不相容;其余6种杀虫剂的相客性较好.并且相客性随着杀虫剂浓度的降低而提高.