鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的制备和鉴定

采用RT-PCR扩增获得鹅星状病毒(Goose astrovirus)的衣壳纤突蛋白基因vp27,并将其克隆至pCold-SUMO原核表达载体。重组表达载体pCold-vp27经过测序和双酶切验证正确后,转化到感受态细胞Rosetta。挑取阳性克隆子,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白,使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白VP27,将定量的重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用ELISA、Western blot和IFA鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体。结果显示,鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的效价大于1∶64 000,Western blot试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的特异性,IFA试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27。     

鹅源星状病毒ORF2基因原核表达及遗传进化分析

应用RT-PCR方法扩增鹅源星状病毒(goose astrovirus,GoAstV)HLJ01株的ORF2基因,将扩增产物克隆至pET32a原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21进行表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到大小约为106 ku的ORF2蛋白,与理论值相符。将诱导表达的蛋白经镍亲和层析柱纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,并测定其抗体效价。Western-blotting结果显示,ORF2蛋白可被鼠抗GoAstV阳性血清识别。序列分析表明,该毒株与其他鹅源星状病毒参考毒株的核苷酸相似性介于37.8%~99.3%之间,HLJ-1801分离株与已发表的8株鹅源星状病毒毒株位于同一分支,表明其属于一种新型星状病毒成员。利用原核表达系统成功高效地表达了GoAstV ORF2蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在。本试验成功获得了纯化的ORF2重组蛋白和小鼠抗GoAstV多克隆抗体,为进一步研究ORF2蛋白对星状病毒感染的诊断试剂的研发奠定了基础。     

一株雏鹅痛风型鹅星状病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

[目的]2017年以来,在中国东部地区的许多鹅场中,4—16日龄雏鹅暴发了严重的痛风,导致2%～20%的死亡率,给养鹅场带来巨大经济损失,本试验旨在分离、鉴定导致此次雏鹅痛风的病原并分析其生物学特性。[方法]将发病雏鹅病料接种10日龄鹅胚,分离病毒,通过PCR、基因测序和系统进化分析对分离的病毒进行鉴定;病毒尿囊液接种鹅肾脏上皮细胞测定病毒滴度;攻毒扬州白鹅雏鹅进行动物回归实验,观察剖检和组织病理变化,PCR方法检测肛拭子和各脏器病毒含量,ELISA方法检测血清中尿酸含量。[结果]从第3代鹅胚尿囊液中分离到一株鹅星状病毒(GAstV),命名为JSHA株。对星状病毒ORF2基因氨基酸进化树的分析结果表明,JSHA毒株与2018年从患痛风的鹅上分离得到的星状病毒毒株(SD01、SDPY、GD)具有99%以上的同源性,而与其他禽星状病毒同源性仅为27.3%～57.0%。阳性尿囊液感染鹅胚肾脏上皮细胞后出现变圆、聚团和脱落等细胞病变,病毒滴度为10~(4.25) TCID_(50)·mL~(-1)。动物回归实验结果显示,该病毒可致雏鹅25%的死亡率,发病鹅体质量减轻、肾脏发白肿胀、脏器表面和关节腔内尿酸盐沉积以及血清尿酸升高;组织病变表现为肾小管上皮细胞变性坏死,尿酸盐结晶形成,大量炎性细胞浸润,肝脏和脾脏中出现坏死区和炎性细胞浸润;组织病毒载量结果显示肾脏、肝脏和脾脏的病毒载量高于其他组织;雏鹅从感染后3 d开始排毒,排毒高峰出现在6～9 d。[结论]鹅星状病毒JSHA毒株是此次雏鹅发生痛风的主要原因。     

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus, nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody, Nb)噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)，然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用...     

一株新型鹅星状病毒鉴定及遗传演化分析

近几年,我国主要养鹅地区暴发了一种以关节腔和内脏器官尿酸盐沉积为特征的高度致死的关节型和内脏型痛风,给我国养鹅业造成了巨大的经济损失.多项研究结果表明,引起此次雏鹅痛风的病原是一种新型鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GoAstV）.为了解GoAstV在广东地区的流行情况及其遗传变异,本研究对广东地区雏鹅群开展GoAstV流行病学调查,结果表明,GoAstV在广东地区雏鹅群中广泛流行,其阳性率为40%.对GoAstV/Guangdong/DBN-1/2019（GoAstV-DBN）进行全基因组测序和遗传演化分析,结果显示GoAstV-DBN与AHAU2/2018同源性最高.与参考毒株相比广东地区GoAstV未发生明显变异,但GoAstV-DBN Cap蛋白发生了Y36V和L540Q两个氨基酸突变.本研究可为广东地区GoAstV的防控和疫苗毒株的筛选提供理论依据.     

安徽省5株新型鹅星状病毒的分离鉴定与遗传进化分析

为研究近年来引起雏鹅痛风病的新型鹅星状病毒流行毒株的病原学和遗传学特征，于2018—2021年从安徽省疑似感染新型鹅星状病毒的雏鹅中采集病料，使用健康鹅胚进行病毒分离，并对分离到的毒株进行全基因组测序和序列分析。结果表明，共分离鉴定到5例新型鹅星状病毒感染样品，利用鹅胚盲传3代成功分离到5株新型鹅星状病毒，均可在鹅胚上稳定传代，分别将其命名为AHAU2018、DY-19、ZY02、HR2105/2和HR2110/1株。全基因组测序结果表明，5株分离毒株的基因组全长均为7 175 nt。系统进化树分析结果表明，5株分离毒株均属于致雏鹅痛风的新型鹅星状病毒，但2019年前的毒株与2019年后的毒株处于不同的进化亚分支上。新型鹅星状病毒在我国已发生变异，出现了新的进化亚分支，但优势基因型是否发生变化还有待进一步研究。     

新型鹅星状病毒FJ-NP株的分离鉴定

[目的] 确定福建某鹅场雏鹅以痛风为主要病征导致高死亡率的病原.[方法] 2019年8月福建省南平市某鹅场暴发一种以痛风为主要特征的疾病,该病在5～20日龄的雏鹅中发病率高达40％,死亡率为80％,对该场采集的3份样品进行实验室检测和病原分离鉴定.[结果] PCR检测结果显示3份样品新型鹅星状病毒均为阳性;细菌分离结果...     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF4基因的原核表达及多克隆抗体的制备

猪圆环病毒2型（PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原,ORF4是PCV2中继ORF1,ORF2,ORF3之后的第四大开放阅读框。本研究以提取的PCV2基因组为模板经PCR扩增获得ORF4基因（386~565 nt）,并克隆到pGEX\|4T\|1表达载体上,构建pGEX\|4T\|ORF4表达载体。经PCR和测序鉴定后,将重组质粒转化受体菌BL21诱导表达并进行目的蛋白GST\|ORF4纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰兔,在免疫期间采血并用间接ELISA对多抗血清进行效价测定。SDS\|PAGE电泳检测结果表明,重组质粒成功表达了目的蛋白。ELISA检测结果显示抗体效价达到1∶12 800以上。Western blot分析表明ORF4融合蛋白具有很好的免疫原性,获得的抗体可以和大肠杆菌表达的GST\|ORF4融合蛋白特异性反应。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。     

鹅星状病毒的流行病学及研究进展

鹅星状病毒（Goose astrovirus, GAstV）是小型无包膜病毒,其基因组由单股正链 RNA 分子组成,基因组长度为 7.1~7.3 kb。GAstV 是星状病毒科禽星状病毒属的新成员,根据基因同源性及遗传距离可将其分为2 个基因群（GAstV-1、GAstV-2）,目前尚未参与官方分类系统。GAstV 感染可导致鹅腹泻、生长抑制,出现以关节尿酸盐沉积和内脏尿酸盐沉积为主的临床症状,被认为是导致鹅痛风的主要病原。目前缺少针对 GAstV的商品化疫苗或治疗药物,主要依靠生物安全措施进行防控。2017 年,我国研究人员于首次在山东省的痛风鹅群中检测并分离到 GAstV 毒株。GAstV 传播速度快,辐射地区广,同年在广东、福建、安徽等地均有相关病例报道,造成高达 12 亿 ~15 亿元的经济损失。GAstV 发病率可达 80%,死亡率可达 50%,GAstV 可导致鹅免疫抑制,在饲养过程中易感染其他病原,造成更严重的临床症状,加大了病原防控难度。GAstV 不仅感染天然宿主鹅,还具有跨越物种屏障的能力,能引起鸡和鸭腹泻、生长抑制,并引发内脏或关节尿酸盐沉积。这提示我们 GAstV 或具有人畜传播的潜力,后续应加强对 GAstV 的流行病学监测,密切关注其传播特性的变化。目前GAstV 的病原检测已取得一定研究进展,且建立了多种能够高效准确地检测 GAstV 的技术方法。但对 GAstV 致病机制的研究尚未深入,疫苗制备方面的研究较为薄弱,且 GAstV 尚无统一有效的体外培养方法,严重阻碍了病原的基础研究。为更好地了解 GAstV 对我国鹅养殖业的影响,本文从 GAstV 的病原学、流行病学、宿主免疫应答和 GAstV 与痛风的关联 4 个方面进行综述,为 GAstV 的后续研究及科学防治提供参考。     

雏鹅新型病毒性肠炎的初步分离和鉴定

从南京某地具典型雏鹅新型病毒性肠炎病变的死亡雏鹅体内分离到一株病毒。用12日龄鹅胚增殖病毒,通过电镜观察到腺病毒样粒子,直径70-120 nm;经与小鹅瘟阳性血清进行中和作用后,接种鹅胚后仍出现死亡。人工感染4日龄健康易感雏鹅,引起发病和死亡,并具有典型雏鹅新型病毒性肠炎的临床症状和剖检特征。用此株病毒感染的鹅胚尿囊液制备的沉淀抗原,经琼脂扩散试验,不能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性沉淀反应。     

小鹅瘟病原分离鉴定及高免卵黄抗体的研制

无菌采取怀疑患小鹅瘟雏鹅的脑、肝、脾、肾等组织样本，健康鹅胚尿囊腔接种分离病毒，经雏鹅保护试验及鹅胚内中和试验鉴定，确诊病雏鹅的病原为小鹅瘟病毒，应用所分离的病毒制备高免卵黄抗体，经效力检验，取得对小蛾瘟攻毒保护100%的良好效果。     

湖南小鹅瘟防治研究 Ⅱ.小鹅瘟疫苗的研制及其应用效果

采用本地小鹅瘟强毒株C-85 F~2成功地研制了鹅胚化小鹅瘟(简称SEP)和鸭胚化小鹅瘟(简称SGD)疫苗,并对两苗进行了安全试验、无菌试验、效力测定试验和田间免疫试验。结果表明,用SEP或SGD原液2lm肌注成年母鹅均安全;经1次免疫(1:1OO SGD或1:100 SEP每只1ml)或2次免疫(1:100 SGD和1:50 SEP每只各1ml)的成年母鹅种蛋所孵的鹅胚或雏鹅,都具有抵抗小鹅瘟强毒的能力,其保护率达90%;在岳阳、怀化等地田间免疫母鹅的跟踪调查,其抵抗自然感染的保护率为95%。     

小鹅瘟病毒的分离与初步鉴定

从死亡的具有典型小鹅瘟症状的7日龄雏鹅肝中分离到1株病毒．选用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产的12日龄鹅胚，进行鹅胚接种试验，雏鹅表现出典型鹅瘟临床症状和剖检特征；鸡胚致死率达到25％；不能凝集多种动物红细胞；能凝集黄牛精子，经琼脂扩散试验，用此株病毒感染的鹅胚液能与小鹅瘟病毒阳性血清发生特异性反应．综上所述，这株病毒初步鉴定为小鹅瘟病毒．     

鹅禽流感的诊治

对鹅禽流感的病原、流行病学、临床症状、病理变化及综合诊断方法进行了总结,并与小鹅流行性感冒、鹅大肠杆菌性生殖器官病、鹅伪结核病进行了类比,最后提出了相应的预防与治疗措施。     

鹅γ-干扰素成熟蛋白的表达及其生物学活性研究

【目的】检测重组鹅IFN-γ的生物学活性。【方法】将鹅IFN-γ成熟蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET30a，杆状病毒转移载体pMelBacA和pBlueBacHis2A。对鹅IFN-γ成熟蛋白进行原核和真核表达系统表达；利用体外活性试验检测表达产物的生物学活性。【结果】原核和真核表达系统表达了重组鹅IFN-γ成熟蛋白，并制备其原核表达产物的多克隆抗体；重组鹅成熟IFN-γ可以诱导鹅巨噬细胞产生NO，并能抑制GPMV在鹅胚成纤维细胞中的增殖。【结论】重组鹅成熟IFN-γ具有鹅巨噬细胞激活活性和抗病毒活性。     

传染性喉气管炎病毒gD蛋白多克隆抗体制备与运用

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一种急性接触性上部呼吸道病。ILTV表面糖蛋白g D能刺激机体产生良好体液和细胞免疫应答,编码该蛋白的g D基因是ILTV主要抗原性基因之一。以ILTV-LJS09株基因组为模板,PCR扩增g D基因主要抗原区域(54~344 aa)及g D基因,分别亚克隆至p GEX-6P-1和p CAGGS载体,构建原核表达载体p GEX-6P-1-g D163/1032和真核表达载体p CAGGS-g D。利用纯化ILTV、原核表达纯化获得重组蛋白r-g D和真核质粒p CAGGS-g D,对新西兰大白兔进行免疫与加强免疫,制备兔抗ILTV g D多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验确定ILTV g D多克隆抗体和ILTV感染的鸡肝癌细胞表达蛋白发生反应,表明制备的ILTV g D多克隆抗体能识别ILTV天然抗原表位,最佳稀释度为11 000;用ILTV感染的LMH细胞培养物进行Western Blot分析,在40 ku左右出现一条特异性条带,与预期ILTV g D蛋白大小相符。激光共聚焦定位感染鸡肝癌细胞中ILTV g D蛋白,发现ILTV g D蛋白主要表达于感染细胞胞浆及融合细胞交界处。