龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（DLCCoAOMT）基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR 研究DLCCoAOMT 基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT 基因,GenBank 登录号为JN093023。该cDNA 全长993 bp,具有1 个744 bp 的完整开放阅读框（ORF）,编码247 个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT 编码的氨基酸序列与其它植物的 CCoAOMT 蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼 DLCCoAOMT 与桦木属的CCoAOMT 蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT 基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT 基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT 基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。     

芒果LAR基因的克隆及其表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyantin reductase,简称LAR)基因是植物原花色素的一个关键基因。本研究根据已经报道的LAR基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,从芒果(Mangifera indica)果实中克隆得到1个LAR基因,其全长c DNA序列为1 221 bp。该基因开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸,等电点为5.78,分子质量为38.38 ku。利用生物信息学在线分析软件对该蛋白组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与棉花、葡萄、蓝莓、柿等具有较近的亲缘关系;对不同芒果品种的LAR基因的表达进行分析发现,绿色的桂七品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

丹参中转录因子基因SmMYB-like 1的克隆和表达分析

利用同源克隆和RACE相结合的方法从丹参中克隆得到1条R2R3 MYB转录因子基因SmMYB-like 1(GenBank登录号为JX997333)的全长cDNA序列。该基因含1个960bp的开放阅读框,编码319个氨基酸,预测其分子量为35.84ku,等电点为6.24。对SmMYB-like 1的氨基酸序列进行多序列比对和系统进化树分析,并对其二级结构和三级结构进行预测。qRT-PCR结果表明:SmMYB-like 1在根、茎、叶和花中均有表达,其中在根中的表达量最低,在叶和花中的表达量较高。构建融合表达载体,利用基因枪轰击洋葱表皮细胞研究SmMYB-like 1蛋白的亚细胞定位,发现该蛋白在细胞核和细胞膜中均有分布。     

猪胰岛素诱导1基因的cDNA克隆和差异表达及蛋白质序列分析

克隆猪胰岛素诱导1(INSIG1)基因,并对其蛋白质序列进行分析。根据人INSIG1基因的保守序列设计1对引物,以猪总RNA为模板,经RT–PCR获得INSIG1基因序列,通过相对荧光定量PCR分析该基因在不同组织中的表达量;将INSIG1基因序列连接到pMD19–T Simple载体上,用PCR检测阳性克隆后测序,并对克隆得到的基因进行生物信息学分析。结果表明,INSIG1基因在肺中的表达量最高,其次是在肝脏,再次是在脾脏,在心脏中的表达量最低;通过克隆,获得了一段999 bp的序列,其中831 bp的开放阅读框编码276个氨基酸;该蛋白不含信号肽序列,与其他动物INSIG1基因氨基酸序列的一致性在71%以上。     

萼脊兰AGAMOUS(AG)基因的克隆与表达分析

通过对萼脊兰AGAMOUS(AG)基因进行结构、功能分析、克隆和AG基因的表达调控等方面的探究,发现,萼脊兰AG的氨基酸序列属于植物特有的MIKC型MADS-box的C类基因,该基因c DNA全长1 002 bp,包含一个702 bp的开放阅读框,该基因命名为AG(登录号KY744276),共编码233个氨基酸。蛋白序列比对和进化树分析表明,AG蛋白与蝴蝶兰蛋白一致性最高,进化距离最近。二级结构分析表明,该蛋白分子属于亲水性蛋白,其中α螺旋占48.93%,延伸链占11.59%,不规则卷曲占39.48%。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,AG基因在花蕾和蕊柱中表达量很高,说明AG基因的表达具有组织特异性,在ABCDE模型中属于C类基因的特征非常明显,控制着雄蕊和雌蕊的发育。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。     

植物monellin甜蛋白基因的细菌化改造合成及其在大肠杆菌中的表达

根据西非植物Dioscoreophyllum cumminisii果实中分离到的monellin甜蛋白的氨基酸序列,首次按照细菌优化密码子,人工合成了全长294bp的monellin甜蛋白基因。克隆后序列分析表明,所获得基因与设计相符。构建了该基因的表达载体pGESP9。经42℃诱导表达,发现所合成甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的22.8%。分离纯化monellin,经测定其甜度是相同重量蔗糖的1100倍,且甜味纯正持久。     

西农萨能奶山羊LXRα基因的克隆、序列分析及组织表达

采集西农萨能奶山羊乳腺组织,利用RT-PCR和RACE技术分离并克隆LXRα基因的cDNA序列。其全长1 654 bp(GenBank收录号为GU332719),包括5′UTR150 bp,CDS1 344 bp和3′UTR160 bp,该基因编码447个氨基酸。经氨基酸序列分析发现,山羊LXRα与GenBank中牛(Bos taurus)、小鼠(Mus muscu-lus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)和人(Homosapiens)的LXRα相似性较高,均在90%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质分子量为50.35 ku,等电点为6.3。具有受体特征结构域:配体结合区域(Lig-and-binding Domain,LBD)、DNA结合区域(DNA-binding Domain,DBD)和锌指蛋白C4型区域(Zinc fingerC4 type,zf-C4)。整个序列具有较强的亲水性且不含信号肽与跨膜结构,该基因定位于细胞核。此外,还通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对LXRα基因进行组织表达分析。在所检测的西农萨能奶山羊11个组织中均有LXRα基因的mRNA存在,其中小肠组织中表达最丰富,乳腺、肝脏、脾脏、皮脂次之,心脏相对最低。     

草菇Volvariella volvacea中乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因vv-pyrG的克隆和序列分析

运用简并PCR和基因组步行技术克隆常见食用菌草菇的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶编码基因（vv-pyrG基因）,并运用生物信息学和系统发育学的方法对所获得的基因进行了序列分析。结果显示：vv-pyrG基因的编码区长度为920bp,含有2个长度分别为65bp和54bp的内含子,可以编码1个含有266个氨基酸残基的蛋白质序列。该氨基酸序列经比对分析,显示与裂褶菌（Schizophyllum commune）和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）的OMPDC序列的相同性分别为58％和64％,相似性分别为74％和78％。对24种真菌的OMPDC氨基酸序列进行系统发育分析表明,系统进化树中草菇与灰盖鬼伞、裂褶菌、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）和白腐菌（Phanerochaete sordida）聚在一起,在节点上的支持率是97％。     

Characterization of a TaJ Gene from Wheat

A novel J-domain protein gene was cloned from wheat （Triticum aestivum L.） using RT-PCR technology and named as TaJ. The J-domain protein is defined by the presence of a J-domain. The cDNA of T. aestivum gene, TaJ （GenBank accession number： DQ789026）, was 1263 bp and contained a complete open reading frame （ORF） encoding a J-domain protein of 420 amino acid residues. The predicted amino acid sequence of TaJ possesses three functionally essential domains： the Nterminal J-domain which includes the highly conserved HPD tripeptide, an adjacent domain that is rich in glycine and phenylalanine residues （G/F） and a Cysteine-rich zinc-finger domain with four repeats of CxxCxGxG that is important for protein interactions. The C-terminal of TaJ was -CAQQ, a farnesylation motif. The full-length deduced amino acid sequence of TaJ is highly homologous to J-domain proteins from various plant species. Southern blot analysis indicated that a single copy of TaJ existed in wheat genome. The expression pattern of TaJ performed by real-time PCR demonstrated that heat shock （HS） at 37℃ induced the expression of TaJ rapidly and strongly, but the response of the TaJ gene to cold stress was much slower than that to HS. Tissue-specific expression analysis showed that the expression level of TaJ gene was much higher in leaves than that in roots.     

花生共生受体类蛋白激酶基因的克隆及生物信息学分析

共生受体类蛋白激酶（symbiosis receptor-like protein kinase, SYMRK）是控制植物与微生物共生的关键调控基因,利用基因组步移技术,克隆得到花生symrk的全长基因及其560 bp的ATG上游序列。采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的常规理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位和高级结构等进行了预测和分析,结果表明Ah-symrk由15个外显子和14个内含子组成,cDNA全长3 042 bp,包含2 781 bp的ORF,编码926个氨基酸,为疏水性酸性蛋白质,定位于细胞膜;ATG上游序列包含3个与根特异表达有关的顺式作用元件root motif tapox1;RT-PCR验证,该基因在花生根中特异性表达。     

花生谷氨酸脱氢酶基因AhGDH1的克隆与生物信息学分析

运用电子克隆技术获得花生1个谷氨酸脱氢酶基因cDNA序列,同时设计引物以花生cDNA为模板进行扩增,经测序得到证实,命名为AhGDH1,GenBank登录号:KT933119。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽导肽、二级结构和三级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:该基因cDNA序列长度为1 713bp,包含1个1 236bp开放阅读框,编码411个氨基酸;该编码蛋白含有谷氨酸脱氢酶两个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与鹰嘴豆等植物的谷氨酸脱氢酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为谷氨酸脱氢酶。     

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析

以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR)体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因(AFP),将其连接到pGEM-Teasy vector载体上,并对其进行生物学信息分析.结果表明:克隆的AFP基因片段全长1 206bp,其中编码区长1 026bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主.与GenBank中(A91926.1)的基因序列和氨基酸序列比较,同源性分别为99.4%和97.6%,表明AFP基因克隆成功.与不同地方品种胡萝卜AFP基因做同源性比较,结果发现不同品种间的AFP基因保持着很高的内同源性.     

苹果NADP依赖的苹果酸酶基因克隆、序列和表达分析

【目的】克隆苹果（Malus×domestica B.）中苹果酸代谢的关键酶基因MdNADP-ME,进行序列特征分析,研究MdNADP-ME在苹果中组织表达的情况。【方法】利用RT-PCR技术获得苹果MdNADP-ME1,2,3全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用荧光实时定量PCR技术研究MdNADP-ME1,2,3的组织表达。【结果】测序结果显示,获得的3个NADP-苹果酸酶基因（MdNADP-ME1、MdNADP-ME2 和 MdNADP-ME3; GenBank 登录号为JX971883、JX971884和JX971885）,其ORF分别为1 512、1 782和1 926 bp,推测其分别编码503、593和641个氨基酸的多肽。氨基酸序列和结构分析显示,这3个基因均含有5个保守的氨基酸区域（motif I-V）,含有2个功能结构域：malic和NAD_bind_1_malic_enz。进化树分析结果显示,MdNADP-ME1 和MdNADP-ME2属于双子叶植物细胞质NADP-ME型,MdNADP-ME3属于双子叶植物质体NADP-ME型。荧光实时定量PCR结果表明,MdNADP-ME1-3在被检测的组织中均有表达,但表达差异明显。【结论】MdNADP-ME1-3属于植物NADP-ME家族,结构高度保守,并且在苹果的不同组织中有不同表达模式。     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.     

白桦抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因克隆及表达分析

从白桦（Betula platyphylla Suk．）cDNA文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长1049bp,其ORF全长750bp,编码250个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为27712．7,理论等电点6．08,保守区分析确定其含有APX蛋白保守序列,属于植物POD超家族。利用实时定量RT—PCR进一步分析白桦苗木在0．8％NaCl胁迫处理下不同时间点APX基因的表达情况。结果表明,盐胁迫处理诱导了APX基因在白桦叶片中的表达,说明APX基因与植物抗盐相关。