miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。     

西农萨能奶山羊激素敏感脂酶基因CDS区的克隆与生物信息学分析

根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种激素敏感脂酶(HSL)基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,利用RT-PCR技术,从西农萨能羊乳腺组织中克隆得到了山羊(Caprar hircus)HSL基因的CDS,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列以及蛋白质结构进行了生物信息学分析.结果表明,山羊HSL基因CDS全长2 271 bp,编码756个氨基酸残基(GenBank登录号为:EU273879),与牛、人和小鼠的核苷酸序列同源性分别为96%、86%和79%;氨基酸序列的同源性分别为96%、85%和83%;其蛋白质的分子量为82 583.7 D,等电点为6.23,其氨基酸序列中存在较强的疏水区域,三级结构存在一个α/β水解酶折叠区域,该特征与牛、人及小鼠的HSL基本一致.     

西农萨能奶山羊LXRα基因的克隆、序列分析及组织表达

采集西农萨能奶山羊乳腺组织,利用RT-PCR和RACE技术分离并克隆LXRα基因的cDNA序列。其全长1 654 bp(GenBank收录号为GU332719),包括5′UTR150 bp,CDS1 344 bp和3′UTR160 bp,该基因编码447个氨基酸。经氨基酸序列分析发现,山羊LXRα与GenBank中牛(Bos taurus)、小鼠(Mus muscu-lus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)和人(Homosapiens)的LXRα相似性较高,均在90%以上。蛋白质结构分析表明,其蛋白质分子量为50.35 ku,等电点为6.3。具有受体特征结构域:配体结合区域(Lig-and-binding Domain,LBD)、DNA结合区域(DNA-binding Domain,DBD)和锌指蛋白C4型区域(Zinc fingerC4 type,zf-C4)。整个序列具有较强的亲水性且不含信号肽与跨膜结构,该基因定位于细胞核。此外,还通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对LXRα基因进行组织表达分析。在所检测的西农萨能奶山羊11个组织中均有LXRα基因的mRNA存在,其中小肠组织中表达最丰富,乳腺、肝脏、脾脏、皮脂次之,心脏相对最低。     

调控山羊乳腺脂肪酸代谢miRNAs筛选及相关pri-miRNAs克隆验证

microRNA(miRNA)是调控脂类代谢的重要分子。本研究采用数据库预测和自由能分析法,筛选与山羊(Capra hirus)乳腺脂肪酸代谢相关的miRNA,并对预测得到的miRNA进行克隆验证。预测结果表明,通过MicroCosm、TargertScan和PicTar3个在线数据库预测与山羊脂肪酸代谢相关的30个基因相对应的miRNA,预测得到50条miRNA,其中3个数据库预测一致的miRNA为13条,2个数据库预测一致的为37条。结果显示,脂肪酸合酶基因(FASN)对应4个不同的miRNA,嗜乳脂蛋白基因(BTN1A1)对应2个,而磷酸甘油酰基转移酶6基因(AGPAT6)没有预测到miRNA靶位点;FASN与BTN1A1的3’UTR上miR-103的结合位点分别有3个和2个。通过MFOLD软件对预测所得的50条miRNA靶位点两侧序列的自由能(ΔG>-20kcal/mol)进行分析,9种miRNA与调控脂肪酸代谢基因相关度较高,分别为miR-103/BTN1A1、miR-15/FASN、miR-23/LPL(脂蛋白酯酶)、miR-27/PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体)、miR-29/GPR41(短链脂肪酸受体)、miR-146/BTN1A1、miR-195/FASN、miR-200/SCD(硬脂酰辅酶A去饱和酶)和miR-497/GPR41,其中miR-103/27/195分别位于BTN1A1、PPARγ和FASN的靶位点与已知物种间同源性较高,增加了这些miRNA/mRNA结合的可能性。此外,靶位点单侧和双侧ΔG小于阈值的miRNA/mRNA分别为14对和9对,其中miR-27/mRNA预测的靶基因为4个,依次为FASN、ACOX1(乙酰辅酶氧化酶基因1)、LPL和PPARγ,miR-103和miR-15的靶基因同为FASN、BTN1A1和ACOX1。以西农萨能奶山羊(Capra hirus)基因组DNA为模板,可扩增出与5条miRNA(miR-103-1/23a/27a/146b/200a)分别相对应的初级miRNA(pri-miRNA);通过序列分析和二级结构分析表明,5条pri-miRNA均包含完整的pre-miRNA序列,同时具有典型的茎环结构,能够产生相应的miRNA。与牛的同源性分析表明,除pre-miR-27a同源性为98%外(山羊pre-miR-27a3’端第11个碱基为G,而牛为A),其余4条pre-miRNA同源性均为100%。因此,本研究筛选的9种miRNA可能调控山羊乳腺脂肪酸代谢,克隆的5条pri-miRNA为其功能研究提供基础。