T3基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立及应用

根据不同基因型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）ORF1a的序列差异,设计T3基因型CTV的特异性引物T3-4F/R,通过优化得到最佳反应条件建立T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR,并进行灵敏性、重复性试验。应用该方法测定柑橘植株中T3基因型CTV分离株含量。建立了一种特异性检测T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,其灵敏性比普通RT-PCR方法高100倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为97.1%,相关性系数为0.992。组内和组间变异系数均小于2.94%,表明该方法重复性好。田间样品中T3基因型CTV含量差异较大,最高含量是最低含量的1 250倍。本研究中建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够准确检测柑橘植株内的T3基因型CTV分离株,可用于研究T3基因型的CTV的变化规律。     

葡萄病毒A实时荧光定量RT-PCR检测技术的建立及应用

根据文献报道和GenBank已登录序列设计引物建立了葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量RT-PCR检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好线性关系,扩增效率为99.2%,决定系数为0.999,可特异性检测GVA,灵敏度高（达常规RT-PCR的100倍）,重复性好。对不同季节、不同品种以及不同部位葡萄样品（嫩叶、嫩叶柄、老叶、老叶柄、卷须和休眠枝条）中GVA的检出率普遍高于常规RT-PCR。不同季节间比较,对秋、冬季样品检测效果最好,除嫩叶外其余部位检出率均达100%,春夏季检出率为10% ~ 100%。不同部位间比较,老叶柄和休眠枝条检测效果最好,检出率均达100%,其次为老叶（80% ~ 100%）,其余部位样品检出率为10% ~ 100%。在大量田间样品检测中,休眠枝条样品检测结果与常规RT-PCR一致,而秋季老叶柄样品检出率明显高于常规RT-PCR。     

葡萄蚕豆萎蔫病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法及应用

建立了葡萄蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus，GFabV）的实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系（扩增效率103.8%，相关系数0.998），灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍，并具有特异性。采用RT-qPCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测，结果表明RT-qPCR方法对GFabV的检出率（96.8%）明显高于RT-PCR（70.8%）。RT-qPCR对休眠枝条中GFabV的检出率达100%，对其他部位样品的检出率均在92%以上，明显高于RT-PCR（42% ~ 97%）。各个发育时期样品GFabV的RT-qPCR检出率（85% ~ 95%）也普遍高于RT-PCR（70% ~ 90%）。该技术对于田间样品的检测适用范围广。     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

应用实时荧光RT-PCR检测柑橘黄化脉明病毒

为更快速准确检测柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）,根据病毒外壳蛋白基因的保守序列设计特异性引物,通过体系优化得到最佳反应条件,建立基于SYBR GreenⅠ的CYVCV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可特异性检测CYVCV,而测试的柑橘衰退病毒、碎叶病毒等5种柑橘病毒均不能检测出。灵敏度较普通RT-PCR提高了100倍,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率和相关性系数分别为102%和0.999。对田间样品的检测结果表明,建立的实时荧光RT-PCR适用于检测不同柑橘品种中CYVCV的含量。     

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

菠萝凋萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus-2,PMWaV-2）是引起的菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple,MWP）的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品,对阴性样品及空白对照均无荧光反应;灵敏度比普通PCR高100倍;重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内,表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。     

柑橘脉突病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

为了快速、灵敏地检测柑橘脉突病毒(Citrus vein enation virus,CVEV),通过设计特异性引物(EVq F4/EVq R4),优化反应条件,建立了CVEV的实时荧光定量RT-PCR检测体系。该方法特异性良好;检测灵敏度比常规RT-PCR高100倍;标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.992,扩增效率101.8%;检测组内和组间变异系数均小于2.85%,重复性较好。利用所建立的实时荧光定量方法对柑橘植株进行检测发现,‘代代酸橙’和‘象山红’植株中CVEV分布不均匀,其中根部病毒滴度最高,分别为162.52和45.32拷贝·ng~(-1) RNA,皮及叶部病毒滴度相对较低。     

沙地葡萄茎痘伴随病毒双重巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank数据库中的沙地葡萄茎痘伴随病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV）全基因组序列设计了2组巢式RT-PCR检测引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2，扩增片段分别为902 bp和438 bp。通过对第1轮PCR扩增中引物组合repF1/R1-cpF1/R1、dNTPs、Taq DNA聚合酶和c DNA用量的优化，以及第2轮PCR扩增中引物组合repF2/R2-cpF2/R2、dNTPs和Taq DNA聚合酶用量的优化，建立了GRSPaV双重巢式RT-PCR检测方法。采用该方法对109份葡萄样品进行检测，结果显示，2对普通PCR引物RSP 52/53和RSP 9F/9R的合计检出率为65.1%,2组单一巢式PCR引物repF1/R1→repF2/R2和cp F1/R1→cpF2/R2的检出率总和为93.6%，而双重巢式PCR引物组合repF1/R1-cpF1/R1→repF2/R2-cpF2/R2的检出率也达到93.6%。该技术在保证检测效率的基础上降低了检测...     

利用RT-PCR检测葡萄扇叶病毒的研究

以一年生品丽珠葡萄品种为试材，改进葡萄叶片总RNA的提取方法，获得了纯度较高、完整性较好的总RNA，在此基础上进行反转录和PCR扩增，检测到了葡萄扇叶病毒（GFLV), 建立了GFLV的RT－PCR检测程序，并得到应用。     

苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法,根据ASPV外壳蛋白基因（coat protein,cp）保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA为标准品构建标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线决定系数达0.996,扩增效率为99%;该方法特异性好,与苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）、苹果锈果类病毒（ASSVd）均无交叉反应;其最低检测限为1.31 × 102 copies ? μL-1,灵敏度比常规RT-PCR高100倍;批内和批间变异系数均小于1.85%。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,适用于田间样品中ASPV的快速定量检测。     

葡萄病毒病多重RT-PCR检测技术体系优化分析

在确立葡萄卷叶病毒Ⅲ和扇叶病毒RT-PCR优化体系基础上,研究了多重PCR的主要成分:dNTPS、TaqDNA聚合酶、MgCl2对PCR反应的影响,从而确立了GLRaVⅢ、GFLV的多重RT-PCR检测体系。研究结果表明,多重PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的用量较单重PCR反应体系要低,而且可降低成本和缩短检测时间。     

葡萄抗炭疽病QTL的初步定位分析

以欧亚种葡萄‘里扎马特’为母本,中国野生刺葡萄‘黑珍珠’为父本进行杂交,随机选择92株后代为作图群体,借助SSR和SRAP分子标记构建遗传图谱,采用区间作图法,对葡萄抗炭疽病相关QTL进行检测并分析。在12号连锁群上检测到1个抗炭疽病相关QTL,其可解释表型变异37.07%,贡献率为71.50%。这表明在12号连锁群检测到的QTL是抗葡萄炭疽病的1个主效QTL。     

马铃薯Y 病毒实时荧光定量RT-PCR 检测体系的建立及应用

根据文献报道和GenBank 已登录序列设计引物建立了马铃薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）实时荧光定量RT-PCR 检测技术体系。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系，相关系数R² 为0.991 2，可特异性检测PVY，灵 敏度达常规RT-PCR 的1 000 倍，重复性好。利用建立的检测方法对山东省、青海省、贵州省、黑龙江省和河北省5 个地区 马铃薯植株中的PVY 进行检测，检出率较常规RT-PCR 技术分别高16.00、33.33、25.00、14.29、20.00 百分点。因此，建 立的PVY 实时荧光定量RT-PCR 检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地检测马铃薯带病种薯和植株 中PVY 的含量，为马铃薯Y 病毒的早期监测和有效防治提供了有效的技术手段。