RAPD分子标记及其在我国蚕业研究上的应用

1 RAPD分子标记 1.1RAPD标记随机扩增多态性DNA(Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)技术由Willams和Welsh等先后于1900提出.该技术主要利用DNA聚合酶链式反应(Polymerase Chain reaction,PCR),以人工随机合成的寡核苷酸单链(为10个核苷酸)为引物,以生物的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应,经过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的多态性.     

牛基因组DNA两种提取方法的比较研究

研究哺乳动物基因组DNA的水煮抽提法，并将传统的酚仿抽提法和水煮法进行比较，水煮法即通过对细胞的煮沸和冷却，使细胞破裂、蛋白变性，从而获得用于PCR扩增的模板DNA的方法。通过电泳分析和PCR扩增检测了所提取基因组DNA的完整性、可行性。检测时采用3对引物对2种方法提取的DNA进行了PCR扩增，同时对冷冻保存的基因组DNA也进行了扩增检测。结果表明：水煮法提取基因组DNA是一种快速、简便、经济、高效的方法。     

应用复合PCR法检测猪圆环病毒

根据基因库中猪圆环病毒（PCV）的基因序列设计引物，建立复合PCR方法，对2株PK－15细胞进行了PCV检测。结果2株PK－15细胞都可扩增出PCV－1的基因片段，其中1株还扩增到了PCV－2的DNA片段。由此可见，应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的，这为PCV的检测、分型及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。     

核酸探针

Waston-Criek的DNA双螺旋构型、DNA的变性与复性性质以及酶学研究的进展、为70年代研制核酸探针铺平了道路。核酸探针是一类新技术的探测手段。它实际上是标记有示迹物质或具有特异性质的RNA或DNA片段。根据核酸双链分子中具有硷基配对的氢键在解链温度或条件下,可将双链解离为单链,而单链探针又能与另     

鸽Ⅰ型副粘病毒的RT—PCR套式PCR检测方法的建立

对3个中国广东的鸽Ⅰ型副粘病毒分离株（P4，P5和P7）基因组RNA以反转录－聚合酶链反应法（RT－PCR）扩增了F基因75％的基因区域（343－1673nt），其中毒株P4和P7准确扩增出预期大小明亮的DNA片段，而P5扩增出片段很淡，用该RT－PCR产物作模板以相同引物再作PCR，结果可以扩增出大小与预期一致的明亮条带，此方法可以快速检测鸽Ⅰ型副粘病毒（PPMV－1）。     

猪3种重要病毒寡核苷酸芯片诊断方法的建立

将猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒-Ⅱ(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)分别应用生物信息学方法,针对病毒基因组保守序列设计特异性强的60-mer寡核苷酸探针,并将其按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片.分别设计出相应的引物,对待测样本进行不对称PCR扩增,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的单链DNA片段,并通过间接荧光标记技术使扩增产物标记上荧光染料.将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交.扫描、分析芯片上荧光信号.试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号.而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号.不对称PCR技术制备的单链DNA片段与寡核苷酸芯片进行杂交反应可同时、快速、特异性地检测多种猪疫病病毒.     

RAPD技术及其在动物遗传育种中的应用

20世纪80年代,由于分子生物学的迅猛发展,限制性酶切片段长度多态性分子克隆、DNA重组技术,尤其是PCR技术的兴起和新的电泳技术的不断完善,从而使各种分子标记应运而生,并在此基础上发展了多种DNA检测技术,诸如:扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、单链构象多态性(SSCP)、简单重复序列(SSR)、测序的标记位点(STS)、数目可变的串连重复序列(VNTR)等等,所有这些技术将为动植物育种、遗传图谱的构建、分子克隆、基因定位等各个方面带来革命性的变化。而RAPD技术由于其在检测DNA多态性上具有独特的方式和…     

16SrDNA PCR法对实验用小鼠细菌感染的检测试验

通过合成细菌16SrDNA高度保守区引物，采用PCR法对16种标准菌株DNA和小鼠 的基因组DNA、人基因组DNA、乙肝病毒、巨细胞病毒进行扩增，PCR法结果表明：细菌具有371bp 扩增产物，与小鼠基因组DNA、人基因组DNA、巨细胞病毒和乙肝病毒无交叉阳性反应。PCR法最低能检测100fg大肠埃希菌DNA。检测实验动物细菌感染，具有快速、特异性和敏感性高的特点。本研究证实：16SrDNA PCR法能够快速，特异地检测实验动物常见细菌感染，具敏感性高。     

我国研制出检测奶牛隐性有害基因新方法

如何保证种奶牛一代又一代品质优良,拒绝遗传病留给下一代,对奶牛隐性遗传缺陷基因的检测非常关键。因此这一领域成为近年国外奶业发达国家研究的热点。李艳华日前在《遗传》杂志发表“利用单链构象多态性检测牛白细胞黏附缺陷症方法的建立”的文章,报告了她的研究成果：利用自行设计的特异性PCR引物．通过对PCR、PCR—SSCP条件的筛选和优化,并结合DNA序列测定．建立了PCR—SSCP检测牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）有害基因的新方法。     

VSV的RT—PCR快速检测方法的建立

选取水泡性口炎病毒N基因序列，设计1对引物，建立检测水泡性口炎病毒的RT－PCR方法。对VSV各毒株进行检测，结果均为引性， 而对反刍动物病毒性疾病相关病毒进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的RT－PCR技术可用于水泡性口炎的诊断和流行病学调查。     

应用随机PCR技术检测未知病毒基因序列的研究进展

随机引物PCR技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD;arbitrarily primed PCR,AP-PCR)是由Welsh、Williams于1990 年几乎同时建立起来的一项DNA多态检测技术 .该技术以 PCR 为基础,利用一系列单一的人工合成的随机寡核苷酸链为引物,对所研究的基因组DNA 进行 PCR扩增.在该技术问世的短短几年内,因其独特的检测DNA多态性的方式以及简便快速等特点而     

中国小型猪SLA-DMA基因的SSCP分析

通过对甘孜藏猪、合作猪、巴马猪以及五指山猪4个群体的SLA—DMA基因第2和第3外显子的PCR-SS-CP和序列多态分析表明：SLA—DMA基因的第2外显子没有多态，但第3外显子有2个等位基因的变异。通过优化低离子强度单链构象多态分型条件（LIS-PCR—SSCP）、克隆测序、菌落PCR、菌落不对称PCR及单链DNA二级结构计算机预测等技术，对第3外显子PCR—SSCP复杂带型进行了准确的判定，J等位基因的带型与单链DNA二级结构计算机预测结果之间存在很高的一致性。4群体中SLA—DMA基因的第3外显子共有JJ／JK／KK3种基因型，均达到了Hardy-Weinberg平衡。其中K等位基因频率高于J等位基因频率。杂合度和多态信息含量的高低依次为：巴马猪、五指山猪、合作猪、甘孜藏猪。除甘孜藏猪多态信息含量为低度多态外，其余群体均为中度多态。     

Southern印迹杂交技术在畜禽疫病诊断中的应用

Southern印迹杂交技术是一种用于检测特定DNA片段的方法。它是将凝胶上分离的DNA片段转到硝酸纤维素膜上后,再通过同位素标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。此法目前已经广泛的应用于动物疾病的诊断以及DNA指纹分析和PCR产物判断等研究。它通常与其他的检测方法结合应用,为特定DNA片段的检测提供了快速、准确、灵敏的方法。而且在Southern印迹杂交技术的基础上又发展了斑点印迹杂交和狭缝印迹杂交两种杂交方法。目前,在畜禽疾病研究方面,Southern印迹杂交技术主要用于病毒及细菌病的检测和分析,但在寄生虫病方面的应用较少。     

特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建

以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核糖体结合位点、gⅢtether和两端茎环结构等元件,成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库,为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白C特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库,是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败菌分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础,对建立有害革兰氏阴性菌分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性菌菌剂设计方法具有借鉴作用。     

鹅肠道微生物区系的PCR-SSCP体系构建

聚合酶链反应 单链构象多态性分析（PCR SSCP）技术是利用DNA单链构象具有多态性进行基因检测的一种快速、简便、较灵敏的分析技术,但其影响因素很多。研究运用PCR SSCP技术分析鹅肠道微生物区系,探讨了凝胶浓度,胶联度,PCR产物的稀释倍数,电泳时间和温度,是否加甘油、尿素和λ 核酸外切酶等因素对SSCP图谱的影响。结果表明,凝胶浓度为12％,胶联度为39∶1,凝胶中不加甘油,电泳电压为120 V,在恒温环境中,试验重复性较好,条带较清晰。因而,在采用PCR SSCP技术分析不同的研究对象,需要对其参数进行最大程度的优化,才能获得试验的成功。     

食品中A族乙型溶血性链球菌的PCR检测

为了建立食品中 A 族乙型溶血性链球菌的 PCR 检测方法，本试验根据 A 族乙型溶血性链球菌（GAS）DNA 酶B 相对保守基因的引物，用乙型溶血性链球菌CMCC32210S（2）为试验菌株，扩增目的DNA 片段，再用市售面包、灭菌乳为模拟样品进行乙型溶血性链球菌添加后的PCR检测。结果均扩增出808 bp的目的DNA片段，证明PCR检测方法特异性强，敏感性好，最低检测限为83.8 pg/μL。     

PCR-RFLP方法在蛔虫种间鉴别上的应用

研究应用PCR－RFLP方法初步鉴别了4种不同蛔虫。从猪蛔虫、人蛔虫、犬弓首蛔虫及鸡蛔虫中分别提取基因组DNA，通过PCR扩增得到长度分别约为450bp、450bp、530bp、550bp的PCR产物。经与国外报道相比较，确认完整扩增出4种蛔虫的第二内部转录间隔区（ITS－2）片段。PCR产物经限制性内切酶HaeⅢ和Hinf I酶切鉴定，通过产生的特异性片段首先可以区分犬弓首蛔虫与鸡蛔虫。通过对4种蛔虫的基因组DNA进行扩增，得到长度分别约为980bp、980bp、1050bp、1070bp的PCR产物。经与国外报道相比较，确认完整扩增出4种蛔虫的ITS－1、ITS－2及5.8S核糖休DNA。PCR产物经限制性内切酶HaeⅢ酶切鉴定，通过产生的特异性片段可以区分出猪蛔虫与人蛔虫。通过PCR－RFLP分析，初步推测猪蛔虫与人蛔虫仍为两个独立虫种，但尚需进一步研究确认。     

猪圆环病毒2型不对称PCR检测方法的建立

为研究制备单链DNA的方法,根据GenBam已发表的PCV-2全基因组序列,设计合成2条特异性引物和1条通用引物,通过pGM-T-PCV-2重组质粒的构建、引物浓度优化、单链PCR产物的杂交测序鉴定,以及敏感性和特异性试验,对PCV-2不对称PCR方法进行了研究.结果显示,上、下游引物用量比为20:1～40:1时,可明...     

采用定量竞争PCR技术定量分析猪DNA

当今的许多肉产品都可能由几种动物的肉按照不同比例组成。为保证消费者不受欺骗，有必要对复合食物产品的成分同时进行定性和定量监测，多聚链式聚合反应（PCR）等以DNA为基础的技术被广泛应用于种类鉴定，但利用当前的技术不能测出某种特定成分的比例，本研究报道了一种用于猪DNA检测和定量分析的定量竞争多聚链式聚合反应技术（QC－PCR的开发和评定，该技术采用一种以生长激素基因sus scrofa为基础的新型猪特异性PCR系统，构建一个与猪的目标序列在长度上仅差30bp的DNA竞争物，与目标序列一起用于PCR。用来自牛、羊、肉鸡和火鸡的DNA对这个新引物的特异性进行了评价，通过含有猪DNA和相应数量牛DNA的混合物的共同扩增使竞争物的浓度调到猪DNA含量的2％或20％。     

RecA 蛋白介导的转基因小鼠制备

受精卵原核内核酸酶对外源基因的降解是导致显微注射法制备转基因动物效率低的重要原因之一,RecA蛋白可与单链DNA结合而阻止细胞核内核酸酶对单链DNA的降解。本试验建立了显微注射和RecA蛋白结合制备转基因动物的技术模型,并初步探讨了RecA蛋白对显微注射法制备转基因动物效率的影响。以单链DNA、RecA蛋白与单链DNA的复合体以及双链DNA为外源基因进行受精卵原核显微注射转基因试验,分别获得F0代小鼠28、41和32只,并通过PCR和Southern blot进行了转基因鉴定。结果显示,在小鼠受精卵原核显微注射RecA＋ssDNA复合体获得的F0代中14．6％（6／41）为转基因个体,显微注射dsDNA获得的F0代中转基因个体占6．2％（2／32）,而显微注射SSDNA获得的F0代中无一为转基因个体。