鹰嘴豆ISSR反应体系的正交优化

鹰嘴豆(Cicer arietinum)ISSR反应体系的建立可以为鹰嘴豆种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位提供理论依据和技术参考。本研究以CTAB法提取的鹰嘴豆DNA为模板,采用L₁₆(4⁵)正交设计直观分析法,对鹰嘴豆ISSR-PCR反应中的4个主要因素(Mg²⁺浓度,引物浓度,TaqDNA聚合酶浓度,dNTPs浓度)在4个水平上进行优化,并在最优ISSR-PCR反应体系的基础上对引物UBC826的最适退火温度进行筛选。结果表明:Mg²⁺和引物浓度对PCR扩增结果有显著影响,dNTPs和Taq酶的浓度变化对PCR扩增结果无显著影响。鹰嘴豆ISSR-PCR优化反应体系(25 μL)为:3 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.24 μmol·L^-1引物,2 U Taq DNA聚合酶。UBC826最适退火温度为56℃。     

灰色家鸽ISSR反应体系的建立与优化

本研究旨在通过正交优化得出灰色家鸽的ISSR-PCR反应的最佳体系。以灰色家鸽为试验材料,使用引物ISSR807,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择,建立了适合灰色家鸽的ISSR-PCR分析的最佳体系。结果表明,灰色家鸽ISSR-PCR反应的最优体系为:25 μL总体积中包括10×PCR Buffer 2.5 μL, Mg²⁺ 2.6 mmol/L, dNTPs 0.2 mmol/L, 引物0.4 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,DNA 模板1.2 ng/μL,最佳退火温度为56.2 ℃。通过对ISSR-PCR反应体系的优化,能为利用该技术进行灰色家鸽遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析奠定基础。     

正交设计优化黑褐苔草ISSR-PCR反应体系

采用正交设计对黑褐苔草（Carexa trofusca）ISSR-PCR反应的Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板进行优化,以期建立最佳反应条件并筛选退火温度。结果表明：黑褐苔草20μLISSR-PCR最佳反应体系为：1.80μmol·L^-1 Mg²⁺、0.60 U Taq DNA聚合酶、0.125μmol·L^-1 dNTP、0.3μmol·L^-1 Primer和50ngDNA模板;引物UBC807适宜退火温度为55℃。该体系能在不同个体中扩增出清晰的、稳定性好的条带。     

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol·L^-1dNTP,0.5μmol·L^-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol·L^-1MgCl₂;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

三角紫叶酢浆草ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计直观分析法,对影响三角紫叶酢浆草ISSR-PCR反应较大的5个因素(Mg²⁺、Taq酶、引物、模板DNA、dNTP)在5个水平上进行优化实验;从100个随机引物中筛选出适宜的引物,并筛选出其最佳退火温度;最后对反应程序进行优化。由此首次建立了适合三角紫叶酢浆草的ISSR-PCR反应体系:25 μL反应液中含10×buffer 2.5 μL,Mg²⁺ 1.25 mmol/L,Taq酶0.9 U,引物0.3 μmol/L,模板DNA 60～100 ng,dNTP 0.25 mmol/L。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性50 s,退火时间60 s(根据不同引物选择对应最佳退火温度),72℃延伸1.5 min,循环40次;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术研究酢浆草属植物提供理论依据和技术参考。     

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),2μL 10×PCR Buffer(mg2+plus),1.5μL dNTP(2.5mmol/L),1.5μL引物(10pmol/μL),50ng模板DNA,ddH2O补足体积。以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃。12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81%。     

结缕草属植物ISSR-PCR反应体系研究

以SDS法提取的结缕草(Zoysia spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg²、dNTP、引物和DNA聚合酶并通过比较不同浓度的模板DNA对PCR扩增的影响,确立结缕草属植物ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同浓度对PCR反应结果有显著影响,正交设计可以用于ISSR反应体系建立,该方法建立的结缕草属植物ISSR-PCR优化反应体系为10X Buffer7、0 ng模板DNA、Mg²+2.0 mmol·L^-1、dNTP 150μmol·L^-1、Primer 0.3μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL;经对11份结缕草属植物进行检验,证明该体系稳定可靠。该体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析等提供依据。     

马蔺ISSR-PCR反应体系的建立与优化

根据正交试验设计原理,设计探索正交试验和细调正交试验以确定马蔺(Iris lacteal Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz)ISSR-PCR反应体系中各成分的浓度,从dNTP、Taq酶、Pri mers、Mg²⁺4种因素对马蔺ISSR反应体系进行了优化,得到适合马蔺的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有dNTP 0.3 mmol/L、Taq酶1.5 U、Pri mers 0.4μmol/L、Mg²⁺2.5 mmol/L以及1×buffer和50 ng模板DNA。通过对马蔺ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,得到这条引物的最佳退火温度为52℃。这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究马蔺遗传多样性奠定了基础。     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

紫花苜蓿耐盐测序扩增区段标记条件优化

以中苜一号紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhang mu No.1)为材料,对SCAR反应中的引物浓度、退火温度、Mg²⁺、dNTP浓度、模板DNA用量及Taq酶用量进行优化。结果表明:在3对SCAR中有2对引物出现目标扩增带,其中以SCAR1的效果最好;适宜反应体系总体积为25μL、Mg²⁺浓度2.5mM、dNTP浓度200μM、引物浓度0.5μM、Taq酶1.5U、模板DNA为50~100ng;优化后的反应体系能得到清晰稳定的SCAR扩增条带,可用于苜蓿耐盐性分子标记鉴定分析。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

正交设计优化草地早熟禾SRAP-PCR反应体系及引物筛选

采用L9(34)正交试验设计方法,对草地早熟禾(Poa pratensis)基因组DNA SRAP PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素的用量进行优化,并比较不同模板DNA用量对扩增的影响,建立草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系,同时,利用该体系对SRAP引物进行筛选。结果表明,草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 1.75 mmol·L-1、引物0.25 μmol·L-1、dNTP 220 μmol·L-1、40 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer,总体积20 μL。运用该体系从100对SRAP引物中筛选出43对引物能够产生清晰稳定的扩增条带且多态性丰富。优化体系的建立及引物的筛选可为今后利用SRAP标记技术对草地早熟禾进行遗传多样性分析、图谱构建、种质资源鉴定奠定技术基础。     

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳（Salix oritrepha）为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20 μL体系中2.0 mmol·L-1 Mg2+ 1 μL,0.10 mmol·L-1 dNTPs 1.5 μL,0.5 U Taq酶用量为1 μL,20 ng·μL-1 DNA模板1 μL, 0.5 μmol·L-1的上下游引物各2 μL,10× Taq Buffer 2 μL,ddH2O加至20 μL。扩增反应程序：94 ℃高温预变性时间3 min,94 ℃变性45 s,Tm(不同退火温度)退火时间45 s,72 ℃延伸30 s,循环数30个,最后72 ℃后延伸时间5 min,4 ℃保温。适宜退火温度为56 ℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。     

海雀稗SRAP-PCR分子标记体系优化及引物筛选

以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L₉（3⁴）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg²⁺2.5 mmol·L^-1、dNTP150 μmol·L^-1、引物0.4 μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。