氮离注入选育β-葡聚糖酶高产为菌株的研究

为获得工业化生产的高产β-葡聚糖酶菌株,试验采用低能氮离子(N )注入诱变筛选的方法,对出发黑曲霉(Aspergillus niger)菌株Y2449进行改良,获得高产菌株SD16.突变株黑曲霉SD16产β-葡聚糖酶酶活由出发菌Y2449的73.00 U/mL提高到493.24 U/mL,产量提高到亲株的7倍,高产菌株SD16经连续5代培养传代,产酶性能稳定.     

复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株

以黑曲霉SD16为出发菌株,经紫外线和N 注入诱变处理,选育高产β-萄聚糖酶菌株.结果表明:紫外线的最佳照射时间为10min,N 最佳注入剂量为70×2.6×1012 N /cm2;突变高产菌株AN1的β-葡聚糖酶酶活由出发菌株SD16的493.2 U/mL提高到902.5 U/mL.且突变菌株AN1经传5代培养,产酶性能稳定.     

西藏牦牛瘤胃源产纤维素酶菌株筛选鉴定及产酶条件探究

为提高纤维素的利用率,寻找到安全性能好、产酶效率高的菌株添加剂添加到饲料中,以提升动物对饲料的利用率,从牦牛瘤胃中分离高产纤维素酶菌株,进行16S rDNA的鉴定,并探究其在不同温度、pH、接种量和发酵阶段产内切型-β-葡聚糖酶、外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的特性。结果表明：通过形态学鉴定以及16S rDNA基因序列测定,最终确定高产菌株M1为克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。M1产内切型-β-葡聚糖酶活性大于外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶;M1在35℃、pH为7、接种量为2%的条件下产内切型-β-葡聚糖酶的效率最高,在30℃、pH为6、接种量为2%的条件下产外切型-β-葡聚糖酶的效率最高,在30℃、pH为6、接种量为1%条件下产β-葡萄糖苷酶的效率最高;在M1生长过程中,先产生了β-葡萄糖苷酶,其次是外切型-β-葡聚糖酶、内切型-β-葡聚糖酶,并且外切酶活性远远大于内切酶和β-葡萄糖苷酶活性。     

纤维素酶高产菌株的选育

从土样中分离筛选出12株产纤维素酶能力较强的菌株。经摇瓶发酵复筛,获得产纤维素酶活较高且稳定的菌株F6,其CMC酶活为887 U/mL,滤纸酶活为210.72 U/mL。以该菌株为出发菌株,经紫外线诱变处理,获得纤维素酶高产菌株4-2-2。将菌株4-2-2摇瓶发酵4 d后,产CMC酶活达3171.598 U/mL,滤纸酶活达1827.372 U/mL,分别比出发菌株提高3.58倍和8.67倍。     

产纤维素酶酵母菌的筛选及鉴定

研究旨在筛选出产纤维素酶较高的酵母菌,并对其生物学特性探讨。试验从生境中筛选到产纤维素酶较高一株酵母菌,通过菌株形态学和分子生物学对该菌株进行了鉴定,并对这株菌的耐酸性、耐模拟肠液性、产酶特性和抑菌能力进行评定。结果表明,所筛酵母菌Y3为酿酒酵母菌,产纤维素内切葡聚糖酶酶活为3.27 U/ml,纤维素外切葡聚糖酶酶活为2.22 U/ml,木聚糖酶酶活为4.21 U/ml,耐酸性、耐模拟胃液较强,而耐模拟肠液能力较弱,不能产生抗金黄色葡萄球菌的物质。试验筛选到酿酒酵母菌Y3是一株较高产纤维素酶菌株并具有良好的生物学特性,对于提高粮食加工副产物的利用率具有非常重要的现实意义。     

西农萨能奶山羊瘤胃产蛋白酶酵母菌的筛选研究

试验旨在从西农萨能奶山羊瘤胃液中分离出产蛋白酶的酵母菌株,并对其产酶能力进行测定。以蛋白酶的活性进行筛选,得到高产蛋白酶酵母菌,对其产酶条件进行优化。经形态学观察及26S rDNA序列分析鉴定出5株产蛋白酶酵母菌,分别对各菌株产酶条件进行优化,在最佳产酶条件下,菌株库德毕赤酵母Y1(时间48 h、接菌量3%、温度30℃、pH值9)产酶活力达229.89 U/mL,东方伊萨酵母Y5(时间48 h、接菌量4%、温度37℃、pH值9)产酶活力达212.63 U/mL,马克斯克鲁维酵母Y16(时间48 h、接菌量3%、温度37℃、pH值9)产酶活力达208.44 U/mL,近平滑假丝酵母Y20(时间48 h、接菌量4%、温度37℃、pH值9)产酶活力达211.74 U/mL,单孢酿酒酵母Y21(时间48 h、接菌量4%、温度30℃、pH值9)产酶活力达209.96 U/mL。同时对五株酵母菌产水解酶的效果进行了探究,发现库德毕赤酵母Y1、马克斯克鲁维酵母Y16、单孢酿酒酵母Y21具有较高的植酸酶活性,达到14.38、15.34、15.63 U/mL;五株菌株均表现出较高的果胶酶活性,其中单孢酿酒酵母Y21显著高于其他菌株(P0.05),达到15.18 U/mL;五株菌株均表现出较高的纤维素酶活性,均超过180 U/mL,其中近平滑假丝酵母Y20显著高于其他菌株(P0.05),达到199.08 U/mL。试验成功分离出5株产蛋白酶菌。库德毕赤酵母Y1、马克斯克鲁维酵母Y16、单孢酿酒酵母Y21具有较高的植酸酶活性。五株菌株均表现出较高的果胶酶活性、纤维素酶活性。     

耐高温β-葡聚糖酶产生菌株的酶学性质的研究

从云南安宁温泉周围土壤中筛选到一株热稳定性能较好的β-葡聚糖酶产生菌W-9,并对其发酵条件及酶学特性进行初步研究。该菌株发酵72h在pH6.0,70℃条件下酶活性为82.64U/mL。对W-9所产β-葡聚糖酶的酶学性质进行研究,结果显示,β-葡聚糖酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,70℃条件下保温时,酶活基本稳定。     

瘤胃表皮葡萄球菌的分离鉴定及其β-葡聚糖酶基因的克隆和在乳酸球菌中表达的研究

为将瘤胃微生物纤维降解酶基因转化到乳酸菌中,从绵羊瘤胃内容物中分离到1株能够降解羧甲基纤维素钠的细菌,经过形态特征及细菌16SrDNA序列鉴定为表皮葡萄球菌。根据表皮葡萄球菌在GenBank中公示的β-葡聚糖酶基因序列设计PCR扩增引物,克隆到2个β-葡聚糖酶基因序列。将2个β-葡聚糖酶基因序列与载体pMG36e连接,构建β-葡聚糖酶基因表达载体,转化到大肠杆菌,并进一步转化到乳酸球菌MG1363,均能表达β-葡聚糖酶,表达酶活达1.47U/mL和1.54U/mL,比原表皮葡萄球菌酶活0.99U/mL高出1.49倍和1.56倍。     

1株产β-葡萄糖苷酶菌株的分离、鉴定与发酵条件初步优化

试验旨在从自然界中筛选β-葡萄糖苷酶高产菌株,对其进行鉴定和产酶条件优化。采用七叶苷显色技术分离和筛选β-葡萄糖苷酶菌株,采用固体发酵技术对其产酶条件进行优化,通过形态学特征及系统发育分析对其进行鉴定。结果表明,在广西河池喀斯特地貌自然植被区筛选出1株产β-葡萄糖苷酶的菌株,将其鉴定为棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）,得到最佳产酶条件为pH值7.0、温度28℃、装液量40 mL/250 mL,经过优化后该棘孢曲霉菌株的产酶能力达到了42.75 U/mL,相较于出发条件提高了10.9倍。研究表明,研究筛选得到的棘孢曲霉能够稳定产生β-葡萄糖苷酶,经固体发酵技术优化后产酶能力得到了较大提高,且在中性条件下产酶量最高,在饲料生产中具有应用价值。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化

本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉（Aspergillus oryzae）。以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。结果显示：菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。     

β-葡聚糖酶产生菌的分离、筛选及鉴定

采用刚果红平板筛选法从动物粪便中分离和筛选高产β-葡聚糖酶的菌株,选取水解圈直径与菌落直径比值较大的菌株进行酶活力的测定,得到一株酶活力较高的菌株T-4-3,酶活力达到21.9 U/mL。对该菌株进行形态观察和生理生化特征分析,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),将其16S rDNA序列与GeneBank中已知标准菌株的16S rDNA序列进行比对,并用Neighbor-joining方法构建菌株T-4-3进化树,结果表明,T-4-3与标准菌株CP000560 Bacillus amyloliquefaciens聚于同一分支,同源性高达100%。     

一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究

为了分离、筛选产纤维素酶益生菌,确定其酶促反应适宜条件,利用羧甲基纤维素钠等作为筛选培养基,结合刚果红染色法,从玉米青贮饲料样品中筛选产纤维素酶益生菌,并通过形态学和系统进化树方法鉴定分离菌。同时对培养时间、pH和温度等酶促反应条件进行了研究。结果表明,筛选出1株可降解羧甲基纤维素,并产生清晰透明圈的菌株。经形态学观察和16SrRNA基因序列分析,鉴定该菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。粗酶液中滤纸酶活为1.5U/mL,外切葡聚糖酶活为1.3U/mL,内切葡聚糖酶活为6.4U/mL,β-葡萄糖苷酶活为2.3U/mL。酶促反应的适宜条件为pH 5.5,温度50℃,粗酶液为培养3d后发酵液上清。解淀粉芽孢杆菌分离株具有一定的产纤维素酶能力,在玉米秸秆生物降解与利用方面具有潜在的开发价值。     

黑曲霉高产纤维素酶活突变株ZM-8的筛选

对航空诱变的黑曲霉(Aspergillus niger)进行筛选,得到纤维素酶高产突变株ZM-8。以玉米秸秆粉为主要碳源,经固体发酵培养,测得其滤纸酶(FPA)、纤维二糖水解酶(C1)、葡聚糖内切酶(CMCase)、β-葡萄糖苷酶(β-Glase)的酶活力分别为110.2、389.9、489.3U/g和1208.1U/g,比出发菌株各组分的酶活分别提高2.1、3.5、1.7倍和1.8倍。经过5次继代固体发酵试验,证明该菌株具有较好的产酶稳定性。     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

试验从萌发的花魔芋实生种子中筛选出一株产β-甘露聚糖酶的内生菌,对该菌株进行鉴定并研究所产β-甘露聚糖酶的酶学性质。采用透明圈法初筛,DNS法测酶活力,摇瓶发酵复筛获得产酶最高的菌株,利用16SrDNA序列分析对该菌株进行鉴定并对所产酶的基本酶学性质进行研究。结果显示,该高产β-甘露聚糖酶的内生菌株与路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii)同源性达99%。所产β-甘露聚糖酶的最适温度为60℃,在30~50℃条件下较稳定;最适pH为6.0,在pH 4.0~9.0的条件下较稳定;Zn~(2+)(117.84%)、EDTA(115.80%)、Cu~(2+)(113.76%)对β-甘露聚糖酶有较强的激活作用,Mn~(2+)(22.02%)对其有强烈的抑制作用;以魔芋粉为底物时,Km值为26.65mg/mL。该菌摇瓶发酵72h后,β-甘露聚糖酶酶活力达9.48U/mL,具有良好的酶学性质,在动物饲料工业中具有广阔的应用前景。     

瘤胃源枯草芽孢杆菌BX1-12的筛选鉴定及其产酶抑菌活性

本试验通过筛选瘤胃环境中具产酶抑菌活性的芽孢杆菌,为开发功能型饲用微生态制剂奠定基础。采用可培养的方法从健康高产奶牛瘤胃液中分离芽孢杆菌,并测定其产酶能力及抑菌活性,同时对筛选到的功能菌株进行生理生化和分子生物学鉴定。结果显示：从健康高产奶牛瘤胃液中筛选出一株芽孢杆菌BX1-12,其产纤维素酶、蛋白酶及α-淀粉酶活力分别为27.33、137.54 U/mL和1450.53 U/100 mL,同时该菌具广谱抑菌效果,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径分别为13.62、23.21 mm和25.97 mm。结合Biolog生理生化实验及16S rRNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。综上,从健康高产奶牛瘤胃液中分离得到的这株枯草芽孢杆菌BX1-12,具有产多种酶活及广谱抑菌的能力,是一株良好的用于奶牛微生态制剂的候选菌株。 [关键词] 奶牛瘤胃液|饲用芽孢杆菌|枯草芽孢杆菌|产酶抑菌活性     

1株耐酸秸秆纤维素降解菌株的筛选、鉴定及其内切葡聚糖酶的异源表达研究

试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中，秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源，从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性，利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定，通过分子克隆技术，构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示，菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL，最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ，异源表达后获得重组酶，分子量约为55 kDa，粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明，试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上，实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达，可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。     

黑曲霉产高酶活纤维素酶突变株ZM-8的筛选

对航空诱变的一株黑曲霉(Aspergillusniger)进行筛选,得到纤维素酶高产突变株ZM-8。以玉米秸秆粉为主要碳源,经固体发酵培养,测得其滤纸酶(FPA)酶活力为110.2U/g、纤维二糖水解酶(C1)酶活力为389.9U/g、葡聚糖内切酶(CMCase)酶活力为489.3U/g、β-葡葡糖苷酶(β-Glase)酶活力为1208.1U/g,比出发菌株各组分的酶活力分别高了2.1、3.5、1.7、1.8倍。经过5次继代固体发酵试验,证明该菌株具有较好的产酶稳定性,可作为以农作物秸秆为原料生产单细胞蛋白(SCP)饲料的优良菌株。     

产β-甘露聚糖酶内生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

试验从萌发的花魔芋实生种子中筛选出一株产β-甘露聚糖酶的内生菌,对该菌株进行鉴定并研究所产β-甘露聚糖酶的酶学性质。采用透明圈法初筛,DNS法测酶活力,摇瓶发酵复筛获得产酶最高的菌株,利用16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定并对所产酶的基本酶学性质进行研究。结果显示,该高产β-甘露聚糖酶的内生菌株与路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）同源性达99%。所产β-甘露聚糖酶的最适温度为60℃,在30~50℃条件下较稳定;最适pH为6.0,在pH 4.0~9.0的条件下较稳定;Zn²⁺（117.84%）、EDTA（115.80%）、Cu²⁺（113.76%）对β-甘露聚糖酶有较强的激活作用,Mn²⁺（22.02%）对其有强烈的抑制作用;以魔芋粉为底物时,Km值为26.65 mg/mL。该菌摇瓶发酵72 h后,β-甘露聚糖酶酶活力达9.48 U/mL,具有良好的酶学性质,在动物饲料工业中具有广阔的应用前景。     

两株益生芽孢杆菌的安全性及酶学性质研究

试验旨在研究两株芽孢杆菌的安全性及产酶特性。对两株芽孢杆菌进行了急性毒性试验、慢性毒性试验、细菌易位试验、有害代谢产物检测、溶血试验、产酶性能定性和产淀粉酶、蛋白酶的定量试验。结果显示：两株芽孢杆菌的安全性良好,无急性毒性、慢性毒性,不会对组织器官产生损害、不易位、不产生有害代谢产物、不溶血。解淀粉芽孢杆菌SSYB株的产淀粉酶能力高于枯草芽孢杆菌LLYB株,但LLYB株的产木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶能力均优于SSYB株,两株芽孢杆菌均无产植酸酶和脂肪酶的能力。SSYB株的产蛋白酶活力为16.6 U/mL,产淀粉酶活力为1.79 U/mL,LLYB株的产蛋白酶活力为50 U/mL,产淀粉酶活力为1.6 U/mL,与定性测定时两株菌产酶趋势一致。研究表明,两株芽孢杆菌的安全性良好,具有产多种生物酶的能力,在饲料添加剂研发方面具有一定的应用前景。     

产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌（B.Subtilis Natto）的筛选及其生物特性研究

采用酪蛋白平板和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板初筛法,分别从北京、大连、日本3个产地的纳豆食品中分离筛选到10株产蛋白酶菌株（NY-1～NY-10）和10株产纤维素酶菌株（NS-1～NS-10）。经酶活力测定NY-1为蛋白酶活力最高菌株,NS-1为纤维素酶活力最高菌株。通过2株菌的生长曲线、芽孢形成曲线、产酶动态变化曲线和酶活力传代稳定性试验,得出NY-1的最佳种龄为16 h,最佳芽孢收获时间为28 h,芽孢量的对数值为(6.92±0.047)、蛋白酶产酶高峰时间为18 h,酶活力为（44.12±1.48） U/mL,;NS-1的最佳种龄为14 h,最佳芽孢收获时间为28 h,芽孢量的对数值为(8.41±0.0060),纤维素酶产酶高峰时间为40 h,酶活力为（60.94±1.22） U/mL,蛋白酶和纤维素酶酶活力在7代内保持稳定。