棉花黄萎病生防菌的筛选及挥发性抑菌物质检测

旨在筛选具有高效抑制棉花黄萎菌的芽孢杆菌并对其挥发性抑菌物质进行检测。采用稀释涂布平板法从棉花、玉米、向日葵根际以及苦豆子植株内分离得到菌株共65株,通过初筛、复筛共筛选到1株高效根际拮抗菌X4和内生菌N4,它们对棉花黄萎菌有较强抑制作用;通过 16S rDNA基因序列分析进行分子鉴定,平板对峙法检测2株生防菌对棉花黄萎菌的抑菌活性,生防菌发酵滤液处理法检测对棉花黄萎菌菌丝生长、孢子萌发、微菌核萌发、毒力蛋白产量的影响,GC-MS法对2株生防菌挥发性抑菌物质进行检测。结果表明:经分子检测2株高效拮抗菌均为芽孢杆菌;经2株1生防菌发酵滤液处理的棉花黄萎菌的菌丝生长受到抑制,菌株N4的抑制率为65.15%、菌株X4的抑制率为58.82%,且菌丝出现严重形变;经处理的黄萎菌孢子萌发率、微菌核萌发率、毒力蛋白产量均显著下降;研究发现2株拮抗菌的挥发性物质具有抑菌作用,GC-MS法检测2株菌发挥性物质主要是2,3-丁二醇、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸和异丁酸,纯品物质检验发现2-甲基丁酸、3-甲基丁酸和异丁酸对棉花黄萎菌均有抑菌活性,2,3-丁二醇没有抑菌活性。可见:2个菌株对棉花黄萎菌具有潜在生防能力,可为生防菌剂的研发提供优良菌种。     

稻瘟病菌磷酸甘露糖基转移酶（PMT）蛋白家族 基因结构特征分析

为阐述稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）磷酸甘露糖基转移酶PMT基因的结构特征及可能的生物学功能,采用序列比对分析方法,明确了稻瘟病菌PMT蛋白家族成员在氨基酸水平的保守性。研究发现它们与来自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、粗糙脉孢霉菌(Neurospora crassa)、玉米赤霉(Gibberella zeae)及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等丝状真菌的PMT蛋白高度同源;进一步生物信息学分析表明,稻瘟病菌PMT蛋白不含有信号肽,为非分泌蛋白,含有跨膜结构域,作用于内质网膜上,具有保守的PMT motif 和MIR motif。研究结果可为进一步阐明PMT蛋白在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的作用机理奠定基础。     

青藏高原土壤放线菌的分离及其对番茄灰霉病菌的抑制活性

为获得具有抑制番茄灰霉病活性的放线菌菌株,对采自青藏高原不同地区的15份供试土样进行选择性分离,采用活体组织法对分离到的放线菌进行抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)活性筛选,并进一步测试高活性菌株发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长和孢子萌发的影响。活性测试结果表明,在分离到的279株放线菌中有28株对番茄灰霉病菌具有60%以上的室内药效,其中6株放线菌对番茄灰霉病菌室内药效可达90%以上,值得进一步研究。     

桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定

[目的]分离并初步鉴定从桃树高发根癌病土壤中获得的拮抗线菌G19菌株的抑菌活性物质。[方法]采用蛋白沉淀法对拮抗放线菌G19菌株的抑菌活性物质进行粗提,利用高效液相色谱仪、中压制备色谱仪对其进行分离、纯化,应用MALDI-TOFMS法进行分子量的测定,最后通过化学显色反应进行相关官能团的验证。[结果]经分离纯化后拮抗放线菌G19的抑菌物质被抨击出7个肽段,是分子量范围为900～1 300 Da,同时推断其含有一个Cys并携带H2O,Na＋;官能团显色反应验证该物质为多肽且含有糖基。[结论]研究结果为拮抗放线菌G19菌株的抑菌物质结构的最终确定奠定了基础。     

瑞香狼毒化学成分抑制PC-12细胞神经突起生长活性研究

对瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)的化学成分进行研究,采用硅胶色谱、凝胶色谱、高效液相色谱等多种色谱手段对瑞香狼毒的乙酸乙酯提取物进行分离纯化,利用NMR、MS波谱分析鉴定3个木质素、1个二萜原酸酯、3个双黄酮、2个黄酮。枇杷素(5)、异落叶松树脂醇(7)和(-)-落叶松树脂醇(8)为首次从该植物中分离得到。PC-12细胞活性试验表明,双黄酮类化合物(狼毒色原酮(2),新狼毒素B(3),异新狼毒素A(4))对NGF依赖的PC-12细胞突起生长有较强的抑制活性(P0.05)。     

韭菜干粉及其提取物对大丽轮枝菌的抑菌作用

为探究韭菜干粉及其提取物对大丽轮枝菌的抑菌作用,将韭菜干粉以土壤质量的2%添加到接种有棉花黄萎菌不同菌量密度的土壤中,开展对棉花黄萎病防治效果及土壤中棉花黄萎菌存活影响的调查研究。结果表明,不同接菌量土壤中添加韭菜干粉,均可显著减少土壤中棉花黄萎菌的数量,降低棉花黄萎病的发生程度。韭菜干粉甲醇提取物抑菌活性成分存在于石油醚、乙酸乙酯萃取物中,两种萃取物合并后通过硅胶柱层析分离,共得到21个馏分,其中有9个馏分的抑菌率达到100%,经GC-MS检测出的活性物质主要为含硫化合物、烯醛醇类化合物、杂环类化合物、阿魏酸衍生物和角鲨烯。其中,角鲨烯和阿魏酸甲酯是首次从韭菜中检测出的抑菌活性物质。     

高效液相色谱法分离纯化小皱蝽抗菌肽AMP-1

用昆虫生理盐水浸提小皱蝽成虫,浸提液冻干后,酸提取法制备粗提液,固相萃取（SPE）初分级分离,活性洗脱组分反相高效液相色谱（RP－HPLC）纯化,进一步凝胶渗透色谱（GPS）及反相高效液相反谱（RP－HPLC）纯化,分离得到一抗菌肽,茚三酮反应黄色,命名为AMP－1。在190nm-225nm短波紫外区,AMP－1有紫外吸收。     

Functional Characterization of a NEM1-Like Gene in Magnaporthe oryzae

Magnaporthe oryzae, a filamentous ascomycete fungus, is well known as the causal agent of rice blast. With the technology of suppression subtractive hybridization (SSH), it was previously found that MGG_06001 (or named MoNEMl), a gene of M. oryzae homologous to the NEMl (nuclear envelope morphology protein 1) gene of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae), is differentially expressed between the mature appressium and the conidium and mycelium. This study aimed to characterize the function of MoNEMl gene by knocking it out using the method of target gene replacement. The AMoneml mutants exhibited reduced mycelial growth and conidiation. However, disruption of MoNEMl gene does not affect the pathogenicity of M. oryzae on barley and rice.     

稻瘟病菌Mofbox基因缺失突变体构建及生物学表型分析

采用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)F-box蛋白的氨基酸序列对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）全基因组数据库进行Blastp分析,找到一个与之同源的、具有典型F-box结构域的蛋白编码基因,命名为Mofbox。采用同源重组原理,将构建的基因敲除载体转化稻瘟病菌,获得该基因缺失突变体2个。研究表明,在稻瘟病菌中,Mofbox缺失后可导致稻瘟病菌生长速率显著下降,分生孢子产孢量和附着胞形成率显著降低,对外源过氧化氢敏感,改变细胞壁完整性,同时降低对大麦和水稻敏感品种CO-39的致病性。     

金钗石斛低聚糖纯品对乳杆菌抗应激能力的影响

利用水作为溶剂从金钗石斛中提取糖类成分,经无水乙醇沉淀脱蛋白质和多糖,再经大孔树脂分离,得到的低聚糖通过葡聚糖凝胶柱,获得1个低聚糖纯品。将纯品冷冻干燥后,添加到乳杆菌的培养基中,分别对乳杆菌的生长曲线、耐热性、抗苯酚抑制作用进行了实验研究,结果表明,金钗石斛低聚糖在促进乳杆菌生长、降低高温对于乳杆菌的伤害和苯酚对于乳杆菌的伤害方面都有明显效果。     

甲基营养型芽孢杆菌BH21对葡萄灰霉病菌的拮抗作用

【目的】甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）BH21是一株对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）有较好拮抗作用的海洋源细菌,鉴定该菌株脂肽类抗菌物质合成基因,检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌的拮抗作用,为应用该菌株防治葡萄灰霉病提供科学依据。【方法】通过特异引物的基因组PCR法检测甲基营养型芽孢杆菌BH21菌株合成脂肽的能力;盐酸沉淀和甲醇抽提法从无菌发酵液中提取脂肽粗提物;排油圈法检测脂肽粗提物的表面活性;采用菌丝生长速率法检测脂肽粗提物对灰霉病菌菌丝生长的抑制作用并计算有效中浓度EC₅₀;利用高效液相色谱技术（HPLC）对脂肽粗提物洗脱分离,并采用菌丝生长速率法检测各组分对葡萄灰霉病菌的抑制能力;采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析主要抑菌成分的脂肽类型。采用离体叶片接种法检测脂肽粗提物对葡萄灰霉病的防治效果。【结果】选取11对特异引物对菌株BH21基因组扩增,其中7对引物扩增出预期核酸片段;扩增产物经测序、BLAST比对分析,结果显示扩增产物与相关菌株脂肽基因相似度为96%-99%,扩增产物翻译的蛋白与相关菌株的脂肽合成蛋白相似度为96%-100%,表明甲基营养型芽孢杆菌BH21基因组中含有ituA、bamD、ituC、ituD、fenD、srfAB、yndJ,该菌株具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的能力。盐酸沉淀和甲醇抽提从LB无菌发酵液中获得脂肽粗提物,得率为428 mg·L^-1。排油圈检测结果显示,脂肽粗提物使橄榄油膜形成排油圈,表明脂肽粗提物具有表面活性。脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌菌丝生长具有显著的抑制作用,脂肽粗提物浓度为440 μg·mL^-1时,对葡萄灰霉病菌菌丝生长的相对抑制率为82.8%。根据毒力方程计算,抑制葡萄灰霉病菌菌丝生长的脂肽粗提物EC₅₀为144.39 μg·mL^-1。HPLC分离纯化脂肽粗提物获得6个组分,只有组分BH21-2和BH21-3抑制葡萄灰霉病菌的生长,RP-HPLC色谱图分析表明组分BH21-2和BH21-3属于fengycin家族脂肽。葡萄灰霉病离体叶片试验结果表明,脂肽粗提物浓度为400 μg·mL^-1时,对葡萄叶片灰霉病防病效果为100%;脂肽粗提物浓度为220 μg·mL^-1时,对葡萄叶片病斑扩展相对抑制率为94.4%。【结论】甲基营养型芽孢杆菌菌株BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多种脂肽类抗菌物质的基因,该菌株脂肽粗提物对葡萄灰霉病菌具有较强的拮抗作用,在葡萄灰霉病生物防治中具有应用潜力。     

草鱼源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药物敏感性分析

从贵州兴义某水库网箱养殖的患病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中分离出菌落大小、形态一致的细菌,编号为GZ09007。经革兰氏染色、生理生化反应等表型鉴定为气单胞菌(Aeromonas)。通过扩增16S rRNA和gyrB基因序列并构建系统发育树,进一步鉴定该菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。该菌株具有act、aer、lip、exu、fla、ser等毒力相关基因,不具有alt、ast、gca T和ahy B等毒力相关基因。人工感染试验表明该菌对草鱼、鲫、团头鲂和鳙均具有强致病性,半数致死量LD_(50)分别为7.45×10~5、1.27×10~5、1.76×10~5和5.36×10~4 CFU·(g·B·W)~(-1)。药物敏感性试验表明该菌对萘啶酸、恩诺沙星和左旋氧氟沙星等12种药物敏感,对新霉素、呋喃唑酮中度敏感,对氨苄西林耐受。研究结果表明维氏气单胞菌GZ09007是引起此次草鱼发病的致病菌。     

MoFbc1调控稻瘟病菌生长与致病机制初探

真核生物体内,F-box蛋白作为泛素连接酶复合物(Skp1-Cullin1-F-box,SCF)的调节亚基,参与降解底物的特异性识别。为探究F-box家族基因MoFbc1在稻瘟病菌生长发育及侵染致病中的功能,采用生物信息学方法分析Mo Fbc1蛋白结构域并构建进化树。利用同源重组方法获得MoFbc1基因敲除及其回补菌株并进行表型分析。结果表明,MoFbc1敲除菌株在产孢、附着胞形成及致病性等方面与野生型菌株均无显著差异。但其在MM和RDC培养基上生长速率下降,表明MoFbc1基因可能参与调控稻瘟病菌对部分营养物质的利用;突变体对细胞壁胁迫因子CFW、CR敏感,提示其细胞壁结构可能发生改变。结果为进一步揭示基因MoFbc1调控稻瘟病菌生长发育机制奠定基础。     

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)NO6的分离、鉴定与除草活性

旨在研究土壤真菌NO6发酵液中对杂草野燕麦具有抑制作用的次生代谢产物。从坎布拉土壤中分离纯化微生物菌株,利用培养皿分析法测定其次级代谢产物除草活性,利用菌落形态和ITS序列对除草活性最高的菌株进行鉴定,进而利用正相硅胶柱色谱、TLC和半制备HPLC方法对其代谢产物中的除草活性物质进行分离纯化。结果表明,共分离获得9株微生物菌株,其中菌株NO6对野燕麦的除草活性最高,将其鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。发酵液经乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析和半制备HPLC分离纯化得到保留时间为66.868min的除草活性物质3。     

近缘毛壳Chaetomium subaffine LB-1抑菌物质存在部位及提取方法

【目的】对近缘毛壳Chaetomium subaffine菌株LB-1产生抑菌物质的部位及提取方法进行研究,为开发生防菌株LB-1防治植物病害奠定基础。【方法】以番茄灰霉病菌Botrytis cinerea和玉米大斑病菌Exserohilum turcicum为指示菌,采用平板密封培养法检测菌株LB-1是否产生挥发性抑菌物质;采用菌体超声破碎和液态培养的方式检测菌株LB-1产生的非挥发性抑菌物质存在的部位;采用含毒培养基法和滤纸片法检测菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀、盐酸沉淀和有机溶剂萃取物的抑菌效果,以确定菌株LB-1培养液中抑菌物质的提取方法。【结果】菌株LB-1与2种供试病原菌密封共培养时,对病原菌的生长没有明显影响,表明菌株LB-1不能产生挥发性抑菌物质。菌株LB-1菌体胞内提取物的抑菌活性与对照无差异,但其培养液对B. cinerea和E. turcicum的生长有较强的抑制作用,表明菌株LB-1产生的抑菌物质存在于菌体细胞外。菌株LB-1培养液的硫酸铵沉淀和盐酸沉淀对2种供试植物病原真菌的生长均无抑制效果,但有机溶剂萃取可获得菌株LB-1培养液中的抑菌物质,其中正丁醇萃取物...     

球孢白僵菌与8种杀虫剂的相容性及其对烟粉虱的室内联合毒力

研究8种杀虫剂与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的相容性及混配后对烟粉虱若虫的毒力。以杀虫剂的田间推荐浓度为初始浓度,采用血球计数法和十字交叉法分别测定其对球孢白僵菌孢子萌发、产孢量和菌丝生长的影响;通过浸渍法测定杀虫剂与球孢白僵菌的室内毒力。结果表明,8种杀虫剂对孢子萌发,菌丝生长及产孢量均有抑制作用,且随杀虫剂浓度减小,抑制作用减弱。球孢白僵菌与印楝素、藜芦碱混用后协同增效作用最好,CTC最大值分别为393和251。因此,在烟粉虱的防治过程中,球孢白僵菌与低浓度杀虫剂混配使用可以起到增效作用。     

土壤链霉菌CaiF1抗菌物质的分离纯化及活性研究

[目的]从土壤链霉菌CaiF1发酵液中分离纯化抗菌物质,并研究该物质的活性。[方法]采用乙酸乙酯萃取、大孔吸附树脂吸附、硅胶层析和制备型高效液相色谱（HPLC）等分离技术纯化抗菌物质,以金黄色葡萄球菌、白粉病菌为指示菌进行活性研究。[结果]土壤链霉菌CaiF1发酵液中抗菌物质得到分离纯化;该物质在pH 2.0～10.0、100℃和紫外照射24 h条件下抑菌活性几乎不变,对白粉病的防治效果达69.7%。[结论]分离纯化的土壤链霉菌CaiF1抗菌物质具有很好的稳定性,为其结构鉴定和开发应用提供理论依据。     

茵陈蒿提取物对几种番茄病害病原真菌的抑制效果

采用生长速率法测定了茵陈蒿乙醇提取物对番茄灰霉病菌、番茄枯萎病菌、番茄叶霉病菌、番茄早疫病菌和番茄晚疫病菌等5种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用,并采用活体组织法测定了其对番茄灰霉病和番茄晚疫病的药效。结果显示,茵陈蒿乙醇提取物对以上5种病原真菌具有较高的抑制作用,其中对番茄叶霉病菌的抑制活性最好,EC50为0.98g/L;在质量浓度为100g/L时,对番茄灰霉病的保护效果为74.00%,对番茄晚疫病的保护效果和治疗效果分别为66.21%和60.01%。     

疣粒野生稻半胱氨酸蛋白酶基因ME085的cDNA全长克隆及序列分析

为了发掘疣粒野生稻抗性基因,从受白叶枯菌诱导的疣粒野生稻叶片抑制差减文库(SSH文库)中选择抗病相关的EST序列,运用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得一个基因全长,命名为ME085。通过生物信息学分析表明该基因全长1 171bp,具有一个750bp的开放阅读框,编码249个氨基酸,其理论等电点为5.76,相对分子质量为27 580.1,存在一个明显的半胱氨酸蛋白酶结构域。推测该基因是一个半胱氨酸蛋白酶基因。     

苦苣菜内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

为开发陕北野生苦苣菜内生菌资源,发现潜在药用活性成分和新的医药先导化合物。以苦苣菜健康植株的根、茎、叶为材料,采用平板对峙培养法测定其对11株供试指示菌的抑菌活性,以苦苣菜提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析、硅胶柱层析和高效液相色谱分析。从中共筛选出95株内生菌,通过抑菌试验发现其中20株对1种或多种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株数的21.05%,其中UG-004、UG-036、UY-085、CY-009、CJ-014、CG-033和CG-035 7株具有较强谱抑菌活性。薄层层析检测结果表明,菌株CG-035的发酵产物在R_f为0.35处有与苦苣菜提取液的层析带迁移率相当的显色带。并通过高效液相色谱分析确定其主要成分为黄酮类物质。菌株CG-035能发酵产生黄酮类或其类似化合物,表明苦苣菜内生菌在次级代谢产物方面具有研究潜力,这为内生菌在微生物药物研究方面提供了理论依据。