一种改良的水稻细胞质基因组制备方法

 水稻叶绿体和线粒体基因组较小,且均被测序清楚,可以作为研究细胞质遗传的良好材料,而如何快速有效地分离纯化获得高产量和高质量的细胞质基因组是从DNA水平上研究细胞质遗传变异的前提条件。本研究结合了蔗糖密度梯度离心法-全基因组DNA扩增法(whole genome amplification,WGA),对细胞质基因组的制备进行了改良。改良后的方法仅使用20g的水稻叶片,即可在2d时间内得到浓度达300ng/μL以上,总量达40μg以上的高纯度(OD260/280值为18~20)、完整的叶绿体DNA (chloroplast DNA,cpDNA)和线粒体DNA (mitochondrial DNA,mtDNA)。该法制备的细胞质基因组可以满足多种细胞质基因组实验的要求,包括Solexa全基因组测序技术的要求。     

小白菜黄化苗培养方法初探

细胞质雄性不育（CMS）广泛存在于高等植物中，它不仅在植物杂种优势利用方面具有重要价值，而且在研究核质互作方面具有重要的理论意义。植物细胞质雄性不育的母性遗传现象，与线粒体和叶绿体两种细胞器有关。现有的研究结果表明，大多数植物的CMS主要与线粒体有关，因此，提取高质量的线粒体DNA是进行线粒体基因组研究的前提。从健壮的黄化苗中提取线粒体DNA可以减少细胞质中叶绿体基因组的污染，从而更加严谨地分析线粒体基因。本文介绍高质量小白菜黄化苗的培养方法。     

油菜细胞质雄性不育的分子机理及其应用研究进展

综述了油菜细胞质雄性不育分子机理的最新研究进展，着重介绍了不同胞质类型Ogu CMS、Pol CMS、nap CMS不育性与线粒体基因组DNA突变的相关性，利用线粒体DNA分子标记进行细胞质雄性不育性的鉴定与分类，并对利用生物技术改良油菜细胞质雄性不育系的前景进行了探讨。     

辣椒细胞质雄性不育相关线粒体基因片段的克隆及序列分析

【目的】探究3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料的不育分子机理,寻找与雄性不育相关的基因。【方法】采用高盐-蛋白酶K法提取辣椒细胞质雄性不育系及其保持系的绿色叶片线粒体DNA(mtDNA),根据已报道的辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,利用PCR反应,从3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料线粒体基因组中均扩增出330 bp左右大小的条带。【结果】经克隆测序及序列分析表明,3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料所获片段序列完全一致,大小为330 bp,命名为CMS330,与orf456核酸序列同源性达99%。【结论】3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料具有相似的不育分子机理。     

枣叶绿体基因组DNA提取方法研究

提取高质量的叶绿体基因组DNA是叶绿体基因组测序分析的重要环节。研究以冬枣、晋枣成熟叶片为材料,采用高盐-低pH法和改良的高盐-低pH法比较研究枣叶绿体分离和叶绿体DNA(cpDNA)提取。结果表明,高盐-低pH法提取的cpDNA,其OD260nm/OD280nm值均为1.28,质量低,不能满足后续测序要求;改良高盐-低pH法提取的cpDNA产量明显得到提高,且cpDNA结构完整、质量高、纯度好,OD260nm/OD280nm值介于1.8~2.0,无降解现象,RNA消化完全,能满足后续测序要求。     

大白菜细胞质雄性不育研究进展

细胞质雄性不育在大白菜杂种优势利用中具有非常重要的应用价值。大白菜细胞质雄性不育主要分为大白菜波里马细胞质雄性不育(Pol CMS)和萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)两种类型。Pol CMS已在生产实践中得到应用,而Ogu CMS在生产应用方面还存在一些问题,需要进一步完善。对大白菜细胞质雄性不育形成机理的研究结果表明,细胞质雄性不育系的花药组织在发育过程中脱落酸和细胞分裂素的含量均高于其相应的保持系,而游离氨基酸(特别是脯氨酸的含量)、蛋白质、可溶性糖等营养物质均低于其保持系。大量的证据表明,线粒体基因组的重组或重排是造成细胞质雄性不育的关键因素,但是目前尚无直接证据表明叶绿体与细胞质雄性不育相关。本研究从以上几个方面综述了近年来大白菜细胞质雄性不育的研究进展,并对其发展前景进行了预测与展望。     

菊芋叶绿体分离方法比较研究

以菊芋叶片为材料,通过比较提取其叶绿体DNA的5种方法(改良高盐-低pH法、Percoll密度梯度离心法、GENMED试剂盒物理法、GENMED试剂盒化学法及DNaseⅠ差速离心分离法),筛选出适合菊芋叶绿体NDA的提取方法。利用显微镜、核酸蛋白测定仪、琼脂糖凝胶电泳及菊芋基因特异引物RAPD检测。结果显示:改良高盐-低pH法分离得到的叶绿体在40×物镜下其数目多,浓度高,背景清晰,提取菊芋叶片cpDNA的OD_(260)/OD_(280)为1.926,质量浓度为295.63μg/μL。经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测发现,cpDNA条带清晰整齐,无核DNA污染;且提取的cpDNA通过4对引物均能扩增到片段。结果表明,改良高盐-低pH法能够快速获得菊芋高质量的叶绿体DNA。     

苎麻线粒体基因CoxⅡ和atpA与细胞质雄性不育相关性分析

 【目的】探讨线粒体CoxⅡ和atpA基因与苎麻CMS的关系。【方法】根据GenBank报道的双子叶植物线粒体CoxⅡ和atpA基因编码区高度保守序列设计简并引物,通过PCR技术从苎麻细胞质雄性不育系、保持系和恢复系(简称“三系”)mtDNA中扩增目的基因片段;采用DNA Walking策略从3′端和5′端扩增基因片段的未知侧翼序列,分离完整的线粒体CoxⅡ、atpA基因;基于全基因序列和基因表达(RT-PCR法)分析这两个基因在苎麻“三系”间的差异。【结果】分离的苎麻CoxⅡ和atpA基因片段与GenBank中一些双子叶植物同类基因的同源性分别高达95%和97%以上,获得的CoxⅡ、atpA全基因包含了完整的开放阅读框。“三系”的CoxⅡ基因在mtDNA水平、转录水平、蛋白质水平上均无明显差异。雄性不育系atpA基因在mtDNA水平、氨基酸序列和蛋白质二级结构上与保持系和恢复系存在比较明显的差异;RT-PCR分析还表明,不育系atpA基因在现蕾期和开花后期的表达量明显低于可育系。【结论】CoxⅡ基因与苎麻CMS可能无关,而不育系atpA基因的序列变异和/或异常表达可能与苎麻CMS关系密切。     

紫丁香与羽叶丁香叶绿体DNA提取方法研究

为了探究适合丁香属植物的叶绿体DNA(cpDNA)的提取方法,采取高盐-低pH法和改良高盐-低pH法分别分离提取了紫丁香与羽叶丁香的叶绿体及cpDNA。结果表明,采取高盐-低pH法提取出的cpDNA,其OD260/OD280值均1.7,且琼脂糖凝胶电泳检测无条带,表明cpDNA质量低,不能满足后续叶绿体基因组测序要求,改良高盐-低pH法提取出的cpDNA,其OD260/OD280值在1.8~1.9,琼脂糖凝胶电泳检测显示条带清晰,无降解现象,表明cpDNA质量高,能够满足后续叶绿体基因组测序要求。研究表明,改良高盐-低pH法可简便快速的提取紫丁香与羽叶丁香的cpDNA,为进一步研究丁香属植物的叶绿体基因组奠定了基础。     

利用线粒体DNA酶切电泳带型对水稻雄性不育细胞质源的分类

为了研究水稻细胞质雄性不育，我们建立了一套提取纯化水稻线粒体DNA的方法轻珍汕97不育系和保持系为材料，发现线粒体DNA的HindⅢ酶切电泳带型存在显著差异，而叶绿体DNA没有差异。细胞质类型为野败型的珍汕97A，V20A、常菲22A的线粒体DNA BamHI酶切电泳后的带型没有差异。属不同细胞质类型的珍汕97不育系和六千辛不育系的线粒体DNA EcoRI BamHI酶切电泳带型不同，它们分别代表了不同的水稻雄性不育细胞质遗传特征。此结果提示，利用线粒体DNA酶切电泳带型可以对水稻不育系的细胞质源进行分类。     

植物细胞质雄性不育和育性恢复基因调控机制研究进展

为了了解细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)通过影响相关基因导致植株雄性不育,细胞核育性恢复基因如何作用于不育基因并使育性恢复。本文综述了有关细胞质雄性不育的作用机制、作用模型、育性恢复调控机制及恢复基因在转录和翻译水平上起作用的研究。指出了细胞质雄性不育因受到多种因素影响而研究不明确,CMS/Rf作用模型在线粒体上的逆行调节信号不确定的问题,在有些农作物的研究上停止不前的现状。因此,提出了未来可以从机制研究和构建更多不育系研究的建议,有助于加强对细胞质雄性不育及其育性恢复调控机制方面的认识,将更好的指导对CMS/Rf遗传调控机理的研究,使细胞质雄性不育在杂种优势遗传育种中发挥更好的作用。     

基于转录组测序对紫花苜蓿细胞质雄性不育系相关代谢通路的鉴定

【目的】研究紫花苜蓿(Medicago sative L.)细胞质雄性不育(CMS)的机理,为紫花苜蓿利用不育系的育种工作提供理论基础。【方法】本研究以紫花苜蓿细胞质雄性不育系MSGN1A及其保持系MSGN1B为材料,进行转录组测序(RNA-Seq)以及基因功能注释,筛选与不育系机理相关的差异表达基因及代谢通路。【结果】Illumina测序共得到紫花苜蓿95 679条功能基因,经过差异表达分析筛选出187个显著差异表达的基因(DEGs),其中包括18个上调基因,169个下调基因。采用GO、KEGG、COG注释库分别对187个DEGs进行功能注释,其主要涉及催化活性、代谢活动、信号传导机制、合成、膜功能、碳水化合物运输和代谢、能量代谢等相关通路。【结论】筛选出与紫花苜蓿细胞质雄性不育性相关的代谢通路,初步探讨了紫花苜蓿细胞质雄性不育系的分子机理。     

辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为试材,从苗龄10~15 d的黄化苗中分离纯化线粒体并提取线粒体DNA。线粒体负染后电镜观察发现,分离纯化的线粒体形态完整,呈椭球形,杂质较少。电泳检测提取的线粒体DNA的琼脂糖,结果表明,线粒体DNA纯度较高,无降解现象,浓度为20~50 ng/μl,可用作RAPD分析。经初步筛选,100个RAPD随机引物中有8个引物表现出多态性,经再次重复筛选,获得了辣椒细胞质雄性不育系21A线粒体DNA与雄性不育性相关的RAPD标记CMSAG3430。     

香蕉叶绿体分离及叶绿体DNA提取方法

根据香蕉叶片自身的特点,对植物叶绿体DNA的提纯方法(高盐低pH法)进行改进,建立适宜香蕉叶绿体分离及叶绿体DNA提取的方法,应用该方法获得的香蕉叶绿体DNA纯度高,香蕉叶绿体DNA的产率达到1.578μg/g,该叶绿体DNA可直接用于限制内切酶酶切分析。方法简便,对仪器要求不高,成本低,也同样适用于其它叶片糖分含量高的植物。     

玉米CMS-C同质异核、同核异质系叶绿体基因组比较分析

【目的】基于玉米细胞质雄性不育材料粗制线粒体DNA高通量测序数据,对叶绿体基因组进行组装。【方法】应用Illumina Hiseq 2500平台进行线粒体DNA测序。利用软件Velvet对过滤后的clean reads进行拼接和叶绿体基因组的组装。采用在线注释软件DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/)对叶绿体基因组完整序列进行基因预测和基因功能分析。【结果】成功组装出C48-2和C黄早四2个不育系及48-2和黄早四2个保持系的叶绿体基因组,大小分别为140 473 bp(C48-2)、140 478 bp(C黄早四)、140 458 bp(48-2)、140 448 bp(黄早四),均包含84种编码基因,30种tRNA基因,4种r RNA基因。新组装的4个叶绿体基因组,在基因组大小及所包含的基因种类及数量方面都与叶绿体参考基因组具有较高的相似性,说明粗制线粒体的高通量测序数据可以用来组装叶绿体基因组。叶绿体基因组高度保守,但也存在SNP及InDel,基于不育系与保持系叶绿体DNA(cpDNA)的SNP位点设计特异引物,可用来鉴定区分CMS-C不育胞质与正常胞质。【结论】利用粗制线粒体DNA的高通量测序数据可以完成叶绿体基因组的组装,玉米CMS-C不育系与保持系的叶绿体基因组具有高度的一致性,但也存在一些多态性位点,基于多态性位点成功开发出可区分CMS-C不育胞质与正常胞质的特异标记。     

辣椒不育系和保持系线粒体差异基因获得及SNP分析

通过对辣椒细胞质雄性不育(CMS)系及其相应保持系育性相关基因的分析,检寻SNP位点,旨在探索其与辣椒细胞质雄性不育性的关系。以高盐-蛋白酶K法提取线粒体DNA,采用AFLP技术分析了辣椒不育系和保持系的mtDNA的差异,从128对引物扩增产物中发现了不育系和保持系的差异片段,经回收、克隆获得不育系特异片段CanLE长度140 bp,保持系特异片段CanLB长度126 bp。利用Blast对其进行序列比对分析,其中CanLE与细胞色素P450家族蛋白同源,CanLB和赖氨酰-tRNA合成酶同源。进一步分别克隆并获得了不育系和保持系辣椒细胞色素P450全长,序列分析发现,两者存在单核苷酸多态性(SNP),其中5个碱基差异,3个为同义突变,2个氨基酸发生改变。     

油菜杂种优势利用的一条可能途径—细胞核＋细胞质雄性不育

油菜细胞核+细胞质雄性不育(GCMS)三系是在综合了波里马细胞质雄性不育(CMS)三系和细胞核雄性不育两系优点的基础上提出的一种油菜杂种优势利用的新途径。本文根据细胞核雄性不育基因的显隐性的不同,将GCMS分成显性细胞核+细胞质雄性不育三系(DGCMS)和隐性细胞核+细胞质雄性不育三系(RGCMS)。     

太行花DNA提取的优化和适用分子标记检测

比较了常规CTAB法、改良CTAB法和SDS法对太行花叶片总DNA的提取效果,并对改良CTAB法提取的DNA在多种分子标记中的适用性进行了测试.结果表明:常规CTAB法提取的DNA难以完全溶解,且有褐化现象;SDS法提取的DNA产率及纯度都很低;改良CTAB法提取的DNA产率高且稳定,无明显降解,杂质少,OD260/OD280值在1.8左右.以改良CTAB法提取的DNA为模板,应用叶绿体和线粒体通用引物扩增出了特异性的高效产物,ISSR和RAPD引物对总DNA的扩增也获得理想结果.因此,改良CTAB法适用于太行花总DNA提取,其产物能满足核、叶绿体和线粒体基因组分子实验的要求.     

植物细胞质雄性不育的生物学研究进展

本文综述了植物细胞质雄性不育系与保持系在细胞学方面、生理生化方面的差异；在分子水平上概述了线粒体和叶绿体与细胞质雄性不育的关系；讨论了环境条件对细胞质雄性不育的影响以及基因工程创造雄性不育的策略、机理。指出决定细胞质雄性不育的胞质因子在线粒体基因组上，提出了本研究领域存在的问题。     

辣椒细胞质雄性不育系与其保持系基因组DNA的RAPD分析

利用RAPD技术对细胞质雄性不育系21A与其相应保持系21B的基因组DNA进行了比较分析,共使用了380个随机引物,其中有213个引物在两系之间都得到了扩增产物,不育系21A与相应保持系21B基因组DNA用213个引物扩增后有6条主差异带,主要表现为条带数目、条带位置和条带强弱的差异.找到了辣椒细胞质雄性不育系21A基因组DNA特异的RAPD片段CMS Y15500、CMS BE5850和CMS BG1900,并对这些特异片段的来源及其在细胞质雄性不育中的作用进行了讨论.