性控冻精的DNA损伤及其检测方法

性控冻精的广泛应用给现代畜牧业带来了巨大的利益。性控冻精在制作生产过程会受到高倍稀释、离心、激光照射、染色及冷冻等诸多因素的影响,而使精子DNA的完整性发生变化,结果降低受胎率,同时会对性控后代的遗传稳定性产生影响。精子DNA损伤检测方法有彗星实验（COMET assay,single cell gel electrophoresis SCGE）,末端转移酶介导的d UTP末端标记法（Terminal tranferase d UTP Nick End Labelling TUNEL）,精子染色质结构分析（sperm chromatin structure assay SCSA）和精子染色体扩散实验（Sperm chromatin dispersion SCD）等。本文综述了近年来精子DNA损伤检测方法的使用概况,对比了不同方法对检测结果的优势,为更好的评价性控冻精的质量,确定分离参数,及为生产受精率高、安全性高的性控冻精提供依据。     

单细胞电泳技术检测低温保存猪精子的DNA损伤

应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE),对冷冻解冻后猪精子DNA的损伤情况进行研究.结果表明,冷冻解冻会对猪精子DNA造成损伤,其彗星率与鲜精相比差异显著(P＜0.05);各组冻精之间,甘油添加量为2%～3%(v/v)时,冷冻对猪精子DNA造成的损伤最低,彗星率均低于其余各组(P＜0.05).     

马鹿XY精子分选及冷冻精液制备试验

为获得分选马鹿X、Y冷冻精液,对电刺激采集的15只马鹿精液经过7h长距离运输,流式细胞仪分离、冷冻,解冻后精液重分析和品质鉴定。结果显示,常规冻精和X、Y型冻精性别比分别为50%、93.11%和95.18%,常规冻精与X、Y型冻精组间差异显著(p<0.05);活率分别为0.45±0.04、0.55±0.04和0.53±0.03,常规冻精与X、Y型冻精组间差异不显著(p>0.05);存活指数分别为0.05、0.05和0.25,常规冻精与X、Y型冻精组间差异显著(p<0.05);顶体完整率分别为72.6±1.0%、74.6±0.5%和72.2±0.6%,常规冻精与X、Y型冻精组间差异不显著(p>0.05)。结论:马鹿XY分选冷冻精液性别比和品质达到性别控制人工授精的要求。     

不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响

将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p＜0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p＞0.05).

Abstract：

Goat semen was centrifuged and divided into three groups:fresh sperm, frozen-thawed sperm and dead sperm by repeated frozen-thawed treatment. The sperms were incubated in vitro with foreign DIG-labeled linear PCS2EGFP plasmid. The transfection rates of the sperms were determined immunohistochemically. The results showed that the sperm DNA-binding rates were (36.61±7.91)%, (32. 68±3.38)%and (69. 36±4.79)%, respectively, for the above-mentioned three groups, and the sperm DNA-binding rate of dead sperms with repeated frozen-thawed treatment was significantly higher than that of the other two groups (p＜0.01).     

德国牧羊犬精液冷冻保存的研究

以德国牧羊犬为实验动物,用两种不同的冷冻方法和剂型对犬的精液进行冷冻,以冻精解冻后的活率作为评定指标,提高犬精液利用效率和扩大犬精液的使用范围。采集4条公犬的精液40次,分别在四种稀释液中稀释,冷冻成两种剂型,根据冻后活率比较优劣。结果表明,稀释液2颗粒冻精的冻后活率显著高于稀释液1、稀释液3和稀释液4(P0.05);对犬的精液进行炸熏法和程序冷冻法冷冻,炸熏法冷冻的精液冻后活率均显著高于程序冷冻法冷冻的精液(P0.05)。     

进口和国产奶牛X性控冻精的效果对比试验

在育成牛发情开始后的20～24h内,输精部位为子宫角大弯至小弯之间的技术条件下,用进口和国产的奶牛X性控冻精分组进行人工授精,情期受胎率分别为：43.10%、58.28%,各组间差异极显著（P〈0.01）;母犊率分别为：在92.00%、91.50%,组间差异不显著（P〉0.05）,试验结果表明：进口和国产奶牛X性控冻精,在快繁高产奶牛中,情期受胎率差异极显著;母犊率均可以达到90.00%以上。本试验对奶牛生产者,在选择奶牛X性控冻精时,具有一定的参考意义。     

流式细胞仪分离奶牛精子性控效果的试验研究

用流式细胞仪分离荷斯坦奶牛的精液,检测在冷冻前和冷冻后分离的精子活力。同时,对不同牛群利用分离得到的性控鲜精和性控冻精进行人工输精,对其人工授精效果和性别控制效果进行观察。结果表明:分选后冻前精子活力达到0.60～0.67,分选后解冻精子活力达0.31～0.39;育成牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精,经产母牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精,但差异均不显著(P>0.05);使用性控鲜精、性控冻精进行人工输精,育成牛群情期受胎率高于经产母牛群,且差异显著(P<0.05);产母犊率差异不显著(P>0.05);用性控精液人工授精的奶牛早期流产率高于非性控精液,但差异不显著(P>0.05)。     

山羊精子介导转染外源DNA的研究

目的:建立山羊精子介导转染外源DNA的方法,并探索精液离心与否与添加异种精清对转染效率的影响.方法:将采集的山羊精液经过离心处理与标记的线形化pEGFP-N1质粒共育转染,分别用免疫组化的方法检测转染效率、PCR和Southern blotting检测转染外源DNA在精子的结合部位和结合率;同时将实验分为3组,分别为鲜精直接转染、离心后转染和离心山羊精液添加猪精清转染,用免疫组化方法检测转染外源DNA效率.结果:精子核后帽区是结合转染外源DNA的主要部位;3种处理的阳性转染率分别为(26.19±3.25)%、(62.04±7.87)%和(17.04±9.34)%;DNaseⅠ消化后的阳性转染率分别为(11.50±5.05)%、(34.00±5.87)%和(10.00±4.24)%.离心组与未离心组和添加猪精清组差异极显著(p＜0.01).结论:山羊精子具有自发性结合外源DNA的能力;羊精清和异种精清明显降低精子结合外源基因的效率.     

玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响

采用乙二醇(EG) 二甲基亚砜(DMSO)作为冷冻保护剂处理并使用微管法冷冻保存猪卵母细胞,运用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(SCGE)方法检测玻璃化冷冻过程对细胞DNA损伤情况.结果显示:保护剂处理冷冻组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.364%、42.059%;同保护剂处理未冷冻对照组82.571%、25.758%的差异显著(P<0.05).表明冷冻保存过程对猪卵母细胞DNA有一定影响:以无冷冻保护剂处理卵母细胞为对照检测保护荆的细胞毒性,对照组形态正常率和DNA异常率分别为84.51%、12.28%,与冷冻保护剂处理组有显著差异(P,0.05).说明冷冻保护荆对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用.     

犬精液冷冻与人工授精的研究——Ⅱ稀释液和冻精剂型对犬冻精解冻后活力的影响

从6条公犬采集其浓份精液36次.分别在稀释液Ⅰ和Ⅱ中冷冻成三种剂型的冻精(颗粒0.5ml细管和安瓿),根据解冻后活力比较其优劣.研究表明:稀释液Ⅰ中三种剂型的平均解冻后活力(0.35±0.04)显著高于稀释液Ⅱ(0.23± 0.05;P<0.01);两种稀释液中颗粒冻精的平均冻后活力(0.34±0.08)显著地高于细管(0.26±0.09;P<0.01)和安瓿(0.26±0.08;P<0.01);细管和安瓿之间差异不显著(P>0.05).     

不同树龄秃杉与杉木人工林木材物理力学性质的比较

对采自广西南丹县山口林场8年生、14年生和28年生的秃杉Taiwania flousiana和杉木Cunninghamia lanceolata人工林木材进行了主要物理力学性质的测定和比较。结果表明：秃杉和杉木的木材密度及主要力学强度均随树龄增加而增大。秃杉木材的气干密度（含水率为12％）、基本密度、径向干缩系数、弦向干缩系数、体积干缩系数、弦面硬度、抗弯弹性模量、顺纹抗压强度、径面抗剪强度和弦面抗剪强度的平均值与杉木相比分别低2．3％,4．4％,1．6％,2．6％,1．5％,3．6％,3．8％,3．4％,17．5％和14．4％,但其端面硬度、径面硬度、抗弯强度、冲击韧性、径面抗劈力和弦面抗劈力的平均值与杉木相比则分别高6．6％,6．1％,3．4％,2．3％,15．0％和16．3％。差异显著性f检验表明,秃杉与杉木人工林的木材密度、硬度、顺纹抗压强度、抗弯弹性模量、抗弯强度、顺纹抗剪强度和抗劈强度均差异显著或极显著,但干缩系数和冲击韧性均差异不显著。图2表3参12     

中间球海胆精子超低温冷冻损伤的研究

应用透射电镜技术研究了超低温冷冻保存对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子超微结构的影响。结果表明：不加抗冻剂的情况下,精子线粒体和顶体结构不完整,质膜、鞭毛破损。加入保护剂后,多数精子结构完好,部分精子细胞器受损,表现为质膜褶皱或膨胀举起,与核膜的间隙明显增大;顶体肿胀、破裂或脱落;线粒体嵴间隙增大,内部出现空泡,甚至线粒体内膜破损,内嵴减少,呈弥散状;鞭毛被膜肿胀,呈波浪状,＂9＋2＂型结构模糊;细胞核结构没有明显变化。应用单细胞凝胶电泳技术研究了精子冷冻保存前后DNA的损伤。结果表明,不加抗冻剂的冷冻组及添加抗冻剂的试验组精子DNA损伤情况与鲜精相比均无显著差异（P〉0.05）,冷冻对精子结构的损伤是造成精子活力及受精率下降的主要原因。     

非繁殖季节提高公羊精液品质的研究

本研究是在非繁殖季节,用电刺激采精法获取5只公羊的精液,对比了其鲜精、冻精与睾丸大小在激素短期处理前后的变化。结果表明,公羊经激素短期处理后,鲜精各指标有了显著（P〈0.05）提高,睾丸的大小也发生了变化。冻后精子的活力比处理前的提高了0.11,顶体完整率提高了6%,均有了显著性（P〈0.05）的变化。     

千烟洲湿地松中幼林树冠生物量及生长量分析

运用枝条解析法对江西省千烟洲19年生湿地松Pinus elliottii枝条生物量及生长量进行估算,建立了树冠生物量及生长量回归模型。结果如下：枝生物量（WR）与枝径（DB）间呈WB=0．0178DB^3.0061的幂函数相关,r^2为0．8408。分枝断面积合计（ATB）与胸径（DBH）间呈ATB=1、8502DRB^1.5418的幂函数相关,r^2为0．75097树冠生物量（Wc）与胸径间呈WC=7．1059 DBH^2.5965的幂函数相关,r^2为0．9205。树冠生物量模型的参数估计及分组检验结果表明：方程的总相对误差在允许范围内．顸估精度总体在90％左右。树冠生长量（Y）与胸径生长量（x）间呈Y=29．354 lx^2.554的幂函数相关,r^2达0．9566。图3表1参23     

CD158受体表位封闭对急性髓系白血病患者NK细胞杀伤活性的影响

目的 研究急性髓系白血病患者NK细胞CD158受体表位封闭对自身白血病细胞杀伤活性的影响.方法 分离急性髓系白血病患者及健康志愿者外周血NK细胞,以自身白血病细胞及K562细胞为靶细胞,用CCK-8试剂盒检测CD158a、CD158b单克隆抗体封闭前后NK细胞在1：1、5：1、10：1效靶比下对靶细胞的杀伤活性.结果 患者与正常人NK细胞对K562细胞均有高度杀伤活性,且随效靶比增大而增高（P＜0.01）.效靶比为1：1、5：1、10：1时,患者NK胞在封闭前对白血病细胞杀伤活性分别为（1.5±0.3）%、（5.6±0.8）％、（11.8±0.6）%,封闭后分别为（21.8±0.7）％、（38.6±0.9）％、（53.9±1.4）％,各效靶比组封闭前后差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 急性髓系白血病患者NK细胞CD158受体表位封闭可提高NK细胞对自身白血病细胞的体外杀伤能力.     

热应激对公兔精液品质、睾丸组织形态及抗氧化指标的影响

为探讨热应激对公兔精液品质、睾丸组织形态及抗氧化物活性的影响,分别测定高温（31±2）℃与适温（18＋2）℃条件下公兔采精量及精子活力、密度、畸形率,并取睾丸组织制作石蜡切片进行组织形态观察及制成组织匀浆测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GsH—Px）、总抗氧化能力（T—AOC）。结果表明：热应激致使公兔采精量、精子活力和密度显著下降（P〈0．05）,睾丸组织细胞严重损伤、数量减少,睾丸组织中MDA含量显著增加（P〈0．05）,而SOD、GSH—Px活性和T—AOC显著降低（P〈0．05）。可见,热应激导致公兔精液品质下降,可能与睾丸组织中抗氧化酶活性降低、自由基生成过多、睾丸组织细胞受损有关。     

松材线虫病病死木木材物理力学性质测定

对当年、前1年受松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus危害的病死马尾松Pinus massoniana及健康马尾松木材的物理力学性质进行了测定。结果表明,松材线虫病病死木木材的静曲强度、弹性模量、抗拉强度、抗压强度、冲击韧性和握钉力与健康材差异显著,密度与健康材差异不显著。健康木材的静曲强度比松材线虫病木材高30％;弹性模量比病材高20％;病木的抗拉强度只有健康材的54．1％～76．9％;健康材抗压强度比病材高出26．8％;健康材冲击韧性比病材高21．0％～32．5％;病木的弦向握钉力是健康材的77．3％～91．7％;径向握钉力是健康材的65．9％～70．1％;健康材密度较病材高出15．0％。表3参11     

缺氧海马神经元中K_（ATP）对p53下游基因α-tubulin表达的影响

目的了解缺氧海马神经元中,KATP对p53下游基因α-tubulin表达的影响。方法原代培养7d后,将神经元随机分为常氧组、常氧＋药物（KATP激动剂二氮嗪和抑制剂甲苯磺丁脲）组、单纯缺氧组（5%CO2,和95%N2）、缺氧＋药物（KATP激动剂二氮嗪和抑制剂甲苯磺丁脲）组,采用倒置显微镜和NF免疫组织化学法观察细胞生长和形态,MTT法检测细胞凋亡率,RT-PCR检测各下游基因的mRNA表达水平。结果单纯缺氧组、缺氧＋二氮嗪组和缺氧＋甲苯磺丁脲组的多级神经元的百分率分别是（20.6±2.0）%、（26.1±1.7）%和（8.7±1.7）%,各加药组与单纯缺氧组比较均有统计学意义（P＜0.01）;细胞存活率分别是（75.7±2.8）%、（55.7±2.5）%和（81.1±2.4）%,各缺氧＋药物组与单纯缺氧组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。缺氧组中α-tubulin的mRNA表达水平与常氧时比较明显下降（P＜0.01）,缺氧＋二氮嗪组和缺氧＋甲苯磺丁脲组的mRNA表达水平与单纯缺氧组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。而在常氧时各用药组中多极神经元的百分率、细胞存活率以及α-tubulin的mRNA表达水平与常氧组相比差异没有统计学意义。结论缺氧时KATP对细胞具有保护作用,KATP对α-tubulin的表达没有显著性影响。     

不同精料水平对新疆驴利用稻草日粮的影响

本实验选用3头雄性健康新疆驴为实验动物,体重132±10Kg,3～4周岁,采用全收粪消化实验方法,分三期进行,研究在3种精料水平（0g／d、400g／d、800g／d）下新疆驴对稻草日粮的利用率。实验结果表明：400g精料组的干物质采食量为3813±284g／d,较0g精料组的3015±265g／d有显著提高（P〈0．01）,较800g精料组3490±238g／d有显著提高（P〈0．05）,干物质消化率随着精料水平的增加有增加趋势（P〉0．05）。400g和800g精料组的粗蛋白采食量、消化率分别为281±50g／d、53．5±5．7％和357±55g／d、59．2±2．2％,都分别显著高于0g精料组的149±42g／d采食量和36．3士3．8％的消化率（P〈0．01）。400g精料组NDF和ADF的采食量都较其它两组有所提高（P〈O．05）,而三组间的消化率无明显差异（P〉0．05）。800g料组磷的采食量、消化率和能量的消化率分别为8．1±2．8g／d、30．8±4．8％和53．5±3．5％,分别较0g精料组有显著提高（P〈O．05）,与400g精料组间无明显差异（P〉0．05）。新疆驴在日喂400g精料下能够较好的利用稻草日粮。