巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

白桦4CL基因启动子克隆及表达分析

为研究4-香豆酸辅酶A连接酶基因(4CL)在白桦木质素合成代谢过程中的组织特异性表达,利用染色体步移法克隆其启动子,用该启动子定向置换pBI121载体的35S启动子,构建重组载体P_(4CL)::GUS。利用瞬时转化法将重组载体转入白桦实生苗茎后进行GUS染色。结果显示:获得了4CL基因编码区起始密码子上游长1344 bp的启动子序列,该启动子除分布有TATA-box、CAAT-box等基本的转录起始元件外,还存在多个顺式作用元件序列位点,包括35S启动子作用元件ASF,参与脱落酸响应的顺式作用元件ABRE,参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif,以及光反应元件G-Box、ACE、4CL-CMA2b等;启动子表达分析结果显示经过瞬时侵染的白桦茎段被染成蓝色。以上结果表明克隆获得的4CL基因启动子具有启动子表达活性,其可能参与了白桦木质部的发育。     

高羊茅FaChit1启动子的克隆及其与gus基因融合表达载体的构建

本研究以获得的FaChit1基因cDNA序列设计引物,采用染色体步移技术从高羊茅基因组中分离了一段FaChit1基因启动子区域。序列分析结果显示,该启动子长度为935bp,含有保守性元件TATA和CAAT-Box,以及与植物逆境胁迫应答相关的多个顺式作用元件,如W-box、ABRE、MYB及MYC转录因子结合位点等。另外构建了含不同长度FaChit1启动子区域(-935bp、-651bp、-233bp)与gus基因融合植物表达载体,分别命名为pFaChit1P-Ⅰ、pFaChit1P-Ⅱ和pFaChit1P-Ⅲ,为进一步进行该启动子的功能分析奠定基础。     

刺五加鲨烯合酶基因DNA和启动子的克隆及分析

在已克隆出的刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)基因cDNA序列基础上,利用TAIL-PCR技术克隆SS的基因组DNA及启动子序列。克隆得到刺五加SS的DNA序列长8 244 bp,启动子序列长1 984 bp,转录起始位点位于起始密码子ATG上游568 bp处。基因包括13个外显子,12个内含子,其剪切符合GT-AG原则。启动子序列含有37个顺式作用元件,其中包括128个TATA-box、38个CAAT-box等核心调控元件,并且含有部分光响应元件、激素应答的元件等顺式调控元件。本研究首次克隆出刺五加SS基因组DNA及启动子序列,为后续研究SS基因表达的调控机制有很大帮助。     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

滁菊f3'h基因启动子的克隆及分析

为探明滁菊类黄酮3'-羟化酶(F3'H)基因在类黄酮物质合成过程中的作用,基于本实验室已经获得滁菊f3'h编码基因的基础上,采用Genome Walking技术,克隆了1 348 bp的启动子,序列分析表明,该启动子片段除含有真核生物启动子核心元件TATA-Box等外,还含有参与脱落酸响应(ABRE)元件以及G-Box等参与光响应单元、植物激素响应单元件植物防御和逆境胁迫应答元件、以及环境因素等多个顺式调控元件。该基因启动子的克隆及其初步分析将为深入研究f3'h基因在滁菊类黄酮合成中的分子机制提供参考、为开发滁菊分子育种提供有效基因原件,以及为今后利用生物技术手段提高滁菊黄酮含量奠定基础。     

核盘菌分枝酸变位酶同源效应蛋白启动子的克隆及功能分析

为了进一步研究分枝酸变位酶同源效应蛋白在核盘菌与植物互作过程中的作用机制,对其启动子进行了克隆和功能分析。采用启动子在线软件Promoter 2. 0和Promoter scan分析分枝酸变位酶同源基因的上游序列,寻找其启动子位点和顺式作用元件,然后通过PCR技术克隆预测启动子的DNA序列,构建荧光蛋白GFP融合载体,转化核盘菌,最后通过检测GFP荧光信号来验证启动子功能。经生物信息学分析发现,该效应蛋白基因上游具有启动子序列特征,包含TATA盒和CAAT盒等顺式元件,采用引物XS1-1和XS1-2进行PCR扩增,得到了733 bp启动子序列,序列包含相关的启动元件,然后以质粒pBlunt NAT-GFP为基础,将经PCR克隆得到的启动子(N-Pro)片段连入载体中,构建得到启动子N-Pro+GFP融合载体,通过REMI技术转化核盘菌原生质体,潮霉素筛选得到了一些转化子,PCR验证融合载体整合到了核盘菌基因组DNA上,最后经荧光显微镜检测到了菌丝GFP荧光信号,结果表明,克隆的分枝酸变位酶同源基因ATG上游733 bp的DNA序列具有启动子功能。     

棉花种子特异表达α球蛋白A基因启动子的功能分析

研究植物种子特异启动子具有重要的理论和实际意义。本文研究了棉花α球蛋白A基因启动子,该启动子序列全长为1640 bp,作用元件分析表明该区域除了具有核心调控序列外,还含有多个与组织特异性相关的顺式作用元件。设计其5'端构建4个不同长度的缺失、融合GUS基因的表达载体,并通过蘸花法分别转化拟南芥。转基因拟南芥GUS表达分析结果表明,该启动子能驱动GUS基因在胚、露白的种子、子叶期的幼苗中表达,而二叶期的幼苗、根、茎、莲座叶、茎生叶和花苞组织则没有表达,说明棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子。208 bp长度的启动子足以维持其种子特异表达功能,而且在启动子的-684和-208区域之间可能存在负调控元件或负调控区域。分析棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子,其基本启动子区域不长于208 bp。     

黑曲霉木聚糖酶结构基因和5'调控区基因克隆及其分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)A3的基因组DNA为模板,根据已报道的xynB基因序列设计简并引物,在合适的PCR反应条件下有效地扩增出了xynB的结构基因及其5＇调控区序列片段,并克隆到pBS-T载体上,序列测定表明,该目的片段全长1 611 bp.通过序列分析:结构基因部分长744 bp,其中含有一个66 bp的内含子和18个氨基酸的信号肽序列;xynB基因的cDNA序列大小为678 bp,编码225个氨基酸,与GenBank上检索的木聚糖酶基因的核苷酸序列同源性最高达98%,氨基酸序列同源性达99%.在翻译起始点上游92 bp和118 bp处找到转录起始位点和类"TATA"box的核心启动子区特征元件以及"CAAT"box,表明所克隆的调控区序列具有真核生物启动子特点,这为构建木聚糖酶高效表达载体,用于工业育种奠定了基础.     

葡萄逆境胁迫诱导启动子的克隆及表达分析

为了研究葡萄抗逆基因(CAN70200.1)的表达特性,采用PCR技术从葡萄中克隆了CAN70200.1基因上游一段长度为1 354 bp的启动子片段,命名为PCAN。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,PCAN启动子序列具有CAAT-box、TATA-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。为验证启动子的表达特性,将PCAN启动子连接到p CAMBIA1391Z载体GUS基因的上游,构建成植物表达载体p1391Z-CAN,并通过农杆菌介导法转化烟草,经PCR鉴定,获得转基因植株。对转基因烟草植株进行逆境胁迫处理发现,在干旱处理120 min后,PCAN启动子活性达到最强;而4℃低温处理30~60 min时,PCAN启动子活性达到最强,表明PCAN启动子具有低温和干旱胁迫诱导表达特性。     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

不同长度AlsCBF基因启动子片段分离及瞬时表达分析

CBF基因在冷驯化过程中发挥重要的作用。本研究依据已克隆的新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因启动子顺式作用元件的分布,构建ACpro-P1(1 110 bp)、ACpro-P2(923 bp)、ACpro-P3(654 bp)和ACpro-P4(350 bp)4个5'缺失植物表达载体;利用烟草叶片注射法瞬时表达分析后进行GUS组织染色分析和定量分析。结果显示这4个片段均具有诱导型启动子活性,启动子Als CBF在-1 391~-1 110 bp之间并无与低温、高盐、干旱三类逆境密切相关的启动子元件;-1 110~-654 bp之间存在大量与低温响应相关的启动子元件;-1 110~-923 bp之间存在能够响应高盐胁迫的元件,而-923~-350 bp之间可能存在一些负调控元件,降低了启动子对高盐的响应;-923~-654 bp之间存在大量与干旱胁迫有关的响应元件。研究结果为进一步分析Als CBF的功能奠定基础。     

苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)启动子区

通过研究苹果赤霉素3-氧化酶1(MdGA3ox1)的启动子来探索MdGA3ox1的转录调控机制。采用染色体步移法结合锚定PCR法扩增了MdGA3ox1的上游序列,用PLANT CARE启动子分析软件分析此启动子序列,并把其构建到载体上,转化入根癌农杆菌中初步验证了其功能。获得一个754 bp的DNA序列,分析此序列发现有CAATbox、TATAbox、赤霉素、光、乙烯、脱落酸等顺式反应元件。把此序列构建到pCAMBIA 1381载体上,并把此质粒命名为p1381-GA3ox1p。把p1381-GA3ox1p转化入农杆菌EHA105中,利用GUS染色液染色,农杆菌呈蓝色。获得了MdGA3ox1的上游序列,此序列上含有与GA调节相关的顺式反应元件,并且初步证明此序列具有启动子活性。     

拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

巴西橡胶HbWRKY55启动子的克隆及功能初步分析

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY55调控天然橡胶生物合成机制,本研究根据已克隆的巴西橡胶树HbWRKY55的序列和橡胶树基因组序列信息设计引物,通过PCR技术获得了HbWRKY55起始密码子ATG上游1 587 bp的序列,利用Plant CARE数据库对该序列的调控元件进行分析。分析结果表明该启动子序列除具有多个典型的真核生物启动子基本元件如增强子元件CAAT-box、启动子核心序列TATA-box等外,还存在赤霉素反应元件GARE-motif、P-box以及水杨酸响应元件TCA-element等参与激素调控的应答元件,同时光应答元件BoxⅠ、Gap-box、Ⅰ-box、L-box、GAG-motif和GT1-motif,胚乳表达的调控元件GCN4-motif、Skn-1_motif和厌氧诱导元件ARE等顺式作用元件也包含其中。构建了该序列的4个5'端缺失片段和荧光素酶基因融合的表达载体,瞬时表达结果表明赤霉素(GA)、水杨酸(SA)可以抑制HbWRKY55启动子的活性,脱落酸(ABA)、茉莉酸甲脂(MeJA)可以加强HbWRKY55启动子的活性。在HbWRKY55启动子的-641~-455和-237~+1可能存在抑制ABA的元件;HbWRKY55启动子的-454~-238和-66~+1存在JA应答增强元件。本研究为深入了解HbWRKY55的调控机理提供帮助。     

茶树硒营养代谢关键酶硒半胱氨酸甲基转移酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因硒半胱氨酸甲基转移酶（SMT,GenBank登录号： DQ480337）的表达调控规律,通过PCR和基因步移技术获得SMT的DNA全长和部分启动子序列,用PLACE、PlantCARE分析SMT内含子和启动子的序列,预测其顺式作用元件及功能。结果表明SMT基因全长5473bp,有7个外显子和6个内含子,内含子富含光响应元件,激素响应元件和抗逆性相关元件,通过基因步移法克隆得到的SMT启动子长375bp,除了含核心启动子保守元件TATA-box和CAAT-obx外,还有其它重要顺式作用元件,如光响应元件、低温响应元件和胚乳表达特异性元件等。植物硒营养代谢关键酶SMT启动子的克隆及结构分析为进一步揭示SMT基因的生物学功能和表达调控机制奠定了理论基础。     

甘蓝型油菜A7-FT启动子的功能分析

为了利用PCR技术得到甘蓝型油菜A7-FT基因启动子序列,根据甘蓝型油菜全基因组序列,利用启动子在线预测软件预测其功能与结构,根据其预测的顺式元件的分布,从5′端开始缺失的方式获得5个不同片段长度的启动子序列。构建含不同片段长度启动子的GUS基因表达载体,利用农杆菌介导拟南芥,得到T_2幼苗,经过GUS染色与脱色,探讨A7-FT基因启动子的功能,为研究甘蓝型油菜开花调控机制提供理论基础。通过PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因DNA中获得A7-FT基因启动子序列。利用PLACE和PlantCARE在线工具对该段序列进行预测,发现A7-FT基因启动子除了存在启动子核心元件CAATbox和TATAbox,还有光应答元件、激素应答元件、胚乳表达应答元件、抗逆性应答元件、生理控制相关的顺式作用元件。基于预测的顺式作用元件的分布情况,设计特异性引物,克隆不同片段长度启动子,与pCAMBIA1303载体构建5′端缺失载体,分别命名为M1、M2、M3、M4、M5。通过农杆菌介导拟南芥,GUS染色与脱色结果显示,在-1 549～-238可能存在一些负调控元件的结合位点,而-238～+1区域是该启动子的核心区段。     

龙眼叶片中CHI和CHS基因启动子序列的克隆与分析*

摘要：为探明龙眼叶片CHI和CHS基因在类黄酮物质合成过程中的作用,本研究应用染色体步移技术,克隆了642bp的 CHI启动子序列CHI-P和613bp的CHS启动子序列CHS-P。利用PlantCARE软件对克隆获得的启动子序列进行分析,结果表明CHI-P和CHS-P均含有核心启动子元件TATA-Box和CAAT-Box。Box I,ABRE,G–Box元件是CHI-P和CHS-P共有的顺式作用元件,这些元件的功能包括参与脱落酸响应（ABRE）与光反应,说明CHI和CHS的表达可能都受到脱落酸和光的调控。此外,CHI-P和CHS-P序列中含有的其他元件说明CHI和CHS的表达还与植物激素及外界环境的诱导密切相关。     

耐盐小麦中TaSC基因启动子的克隆及调控功能分析

高盐是小麦的主要非生物胁迫因子之一, 发掘小麦耐盐品种中的相关基因, 分析其调控机理, 有助于解析小麦耐盐性机制。本文利用TAIL-PCR和电子克隆的方法, 从耐盐小麦RH8706-49中克隆了耐盐基因TaSC的启动子序列, 命名为ProTaSC。该DNA序列中存在多个顺式作用元件, 包含与非生物胁迫响应有关的ABA响应元件(ABRE)和MYB蛋白结合位点(MBS)各1个。以GUS为报告基因, 对克隆的启动子序列及不同长度的5′端缺失片段的表达活性分析表明, 克隆的全长片段及2个5′端缺失的片段(681 bp和1096 bp)均能启动GUS表达, 而小于等于343 bp的片段不具备启动功能, 说明ProTaSC中从-681位到-343位核苷酸之间的区域为核心启动子区。在ProTaSC:GUS转基因拟南芥的根、叶片、花药、萼片及成熟角果的果荚壳中均检测到GUS蛋白, 而在主茎、花瓣、幼果和种子中没有检测到GUS, 表明ProTaSC是组织表达特异性启动子。对ProTaSC:GUS转基因拟南芥在NaCl (200 mmol L^-1)和ABA (10 μmol L^-1)胁迫处理后的GUS定量分析表明, ProTaSC是受NaCl和ABA显著诱导表达的功能序列。     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。