不同因素对牛IVF胚胎体外发育影响的研究

为进一步完善牛胚胎体外发育体系,以体外受精胚胎为研究对象,对精子获能液、胚胎培养液、血清与BSA添加浓度、卵丘细胞共培养等影响体外胚胎发育体系的各个因素进行筛选优化。结果表明,BO获能液比普通获能液能够获得更高的卵裂率;添加葡萄糖、BSA以及不同浓度血清的牛胚胎培养液比未添加组有更好的发育效果,卵裂率、囊胚率分别达到(79.85±0.74)%、(28.69±1.45)%;在此基础上,牛卵丘细胞与牛胚胎共培养可将囊胚率进一步提高至(32.70±1.73)%,并用免疫荧光染色验证其卵丘细胞未发生凋亡。本研究进一步优化了牛胚胎体外发育体系,提高了体外胚胎的囊胚发育率。     

奶牛性控胚胎体外生产的影响因素及控制措施

针对奶牛胚胎体外生产环节,对体外受精和培养等技术进行了研究,旨在建立奶牛性控胚胎体外生产技术体系。结果表明,卵母细胞外周卵丘细胞至少保持3层以上,在成熟基础液中添加10 ng/ml的EGF,利于核质成熟;在精子获能液中添加咖啡因降低精子的存活时间;牛胚胎前3 d用CR1aa+BSA培养,再用SOFaa+5%FBS培养,获得高的囊胚发育率,并且添加50 ng/ml IGF-I后胚胎的发育得到了很大的改善。利用性控精液进行体外受精,受精率有轻微下降,但对生产的胚胎发育质量无明显（P>0.05）影响,胚胎移植后受胎率为40%左右。     

组织蛋白酶抑制剂E-64对猪卵母细胞体外发育能力的影响

为探明外源性组织蛋白酶抑制剂(E-64)对猪卵母细胞体外发育能力的影响,通过向成熟液中添加1、5、10μmol/L的外源性组织蛋白酶抑制剂,对猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养46 h,统计第一极体率,随后分别进行体外受精和孤雌激活,统计第2天的卵裂率和第7天的囊胚率。结果表明,成熟液中加入1μmol/L E-64的第一极体排出率显著高于未添加的对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组。将体外成熟的卵母细胞进行体外受精及孤雌激活,体外受精后胚胎的卵裂率与囊胚率结果均为成熟液中加入1μmol/L E-64的添加组显著高于对照组以及5、10μmol/L E-64的添加组;孤雌激活后,4组间胚胎的卵裂率差异不显著,囊胚率为10μmol/L E-64的添加组显著低于其他3组。因此1μmol/L E-64能促进猪卵母细胞的核成熟,并能进一步提高其体外受精后的卵裂率和体外培养的囊胚率。     

受体卵母细胞来源和供体细胞类型对山羊体细胞核移植融合率的影响

以波尔山羊体细胞作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同供体细胞类型对核移植重构胚融合率的影响。结果:以体内成熟和FSH处理卵巢、屠宰场卵巢来源的体外成熟卵母细胞做核移植受体卵母细胞,重组卵的融合率分别为71.9%,78.4%,73.1%,三者之间差异不显著;以卵丘细胞和皮肤成纤维细胞做核供体,重组卵的融合率分别为77.1%,68.3%,二者之间差异显著。     

牛兔异种体细胞以兔卵母细胞为核受体的牛体细胞克隆研究

随着同种动物克隆后代的不断降生,人们又开始尝试异种动物体细胞核移植。用兔的卵母细胞作为核受体进行牛的体细胞核移植,研究表明,颗粒细胞作为供核体与兔去核卵母细胞的融合率(60.5%,57.9%)稍高于皮肤成纤维细胞的融合率(52.2%,48.4%),但两者间差异并不显著。颗粒细胞与皮肤成纤维细胞均采用饥饿培养和接触抑制培养两种不同的方式进行诱导处理,融合卵在电激活后能够卵裂并发育的情况差异显著(72.6%对51.4%;70.4%对52.2%)。有少数重构胚发育至囊胚,证明在哺乳动物异种重构胚早期发育中,异种细胞核与细胞质间是相容的。     

波尔山羊胚胎克隆的研究

以波尔山羊早期胚胎卵裂球作为核供体进行核移植,比较受体卵母细胞来源以及不同发育阶段胚胎的卵裂球对核移植重构胚的融合率的影响,研究Vero细胞对重构胚体外发育的影响,检测重构胚发育成为个体的能力。结果表明:以体内成熟和体外成熟卵母细胞做核移植受体,重组卵的融合率分别为85.7%和88.7%,二者之间差异不显著(P>0.05);以来源于8,16,32细胞阶段的卵裂球做核供体,重组卵的融合率分别为91.6%,86%,89.2%,三者之间差异不显著(P>0.05);融合后的重构胚与Vero细胞单层共培养,卵裂率65.5%和桑椹胚率32.7%均高于单纯TCM199培养的53.1%和10.6%(P<0.05);移植18枚融合后的重构胚于2只受体山羊输卵管,结果未获得妊娠;移植经体内培养得到的3枚桑椹胚于受体山羊子宫内,获得妊娠1只,总体的妊娠率为33%(1/3),怀孕的受体羊维持妊娠到期,产下1只母羔,初生重3.45 kg,一周岁时体重达到42.5 kg。通过自然交配产下一对波尔山羊羔。     

卵泡液对牛卵母细胞发育潜力的影响

为了确定卵泡液(直径大于10 mm)对卵母细胞成熟的影响,共收集1759枚卵母细胞进行试验。在成熟液中分别添加0%,10%,30%和50%的卵泡液(bFF, bovine follicular fluid ),成熟培养24h后,孤雌激活或者体外受精和胚胎培养;对比10% bFF和10% 胎牛血清（FBS）,以及观察微滴培养对卵母细胞成熟的影响。结果表明,在孤雌激活组中,bFF浓度对卵裂率的影响差异不显著,但胚胎囊胚发育率高于对照组（P<0.05）;在体外受精组中随着bFF浓度增加而卵裂率下降(P<0.01),而且囊胚率也下降(P<0.05)。在10%的bFF组中,孤雌激活囊胚率和体外受精囊胚率分别为47.1% 和38.0%,囊胚扩张率显著高于其它组。从试验得出,添加10% bFF有利于卵母细胞胞质成熟,且不会降低到受精率,而且可以替代FBS;微滴培养不利于卵母细胞成熟。     

不同冻精处理方法和添加咖啡因对牛体外受精的影响

【目的】为了探讨不同冻精处理方法以及添加精子活力激活剂并孵育不同时间获能对体外受精及受精卵发育的影响。【方法】研究对体外受精前的牛冷冻精液分别采用直接离心法、上游法和Percoll法3种方法处理,并对处理后的精液分别用含2.5mM或5.0mM咖啡因的获能液（BO液＋10μg/ml肝素钠）在培养箱内预先孵育10min或30min进行获能,不同处理的精子经体外受精后。【结果】结果表明：（1）3种冻精处理方法（直接离心洗涤法、上游法、Percoll法）对精子处理获能,IVF后受精卵的卵裂率（依次为51.58%、52.83%、53.20%）均无显著差异（P＞0.05）;桑椹胚、囊胚发育率Percoll法处理组（16.66%、10.18%）与上游法处理组（17.85%、16.07%）以及Percoll法处理组与直接离心洗涤法组（8.77%、7.01%）均无统计学差异（P＞0.05）,同时实验结果还表现出上游法处理组比Percoll处理组的桑囊胚率有所提高,且上游法处理组与洗涤法处理组在桑、囊率上出现了显著差异（P＜0.05）。（2）获能液中添加咖啡因组比非添加组(对照组)卵裂率和桑囊胚率有所增加,其中添加5.0mM咖啡因组精子孵育30min的获能效果最佳,卵裂率、桑囊率达到68.59%、28.50%。【结论】以上结果表明上游法处理牛冷冻精液稍优,更有利于以后的受精卵发育;添加咖啡因能提高精子活力,且高浓度的咖啡因维持精子高活力持续时间较长。     

外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的影响

了研究外源性孕酮对牛卵母细胞体外核成熟的作用,通过向成熟培养液中添加10 μg/mL FSH +10 μg/mL LH（对照组）和0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL的外源性孕酮,对牛卵丘卵母细胞复合体进行体外成熟培养,在培养8 h后用醋酸地衣红染色观察各自的生发泡破裂率,然后在成熟22 h统计第一极体率,体外受精后7~8天统计囊胚率。结果表明,对照组卵母细胞的生发泡破裂率(75.0%)和极体率(79.6%)均明显高于添加不同浓度孕酮的各处理组(P<0.05),而囊胚率各组之间均无显著差异(P>0.05)。因此,外源性孕酮不能促进牛卵母细胞的核成熟,单独添加外源性孕酮不能起到与内源性孕酮相同的作用。     

猪体细胞胞质注射核移植研究

首例体细胞克隆动物“多利”羊诞生以来,各种体细胞核移植动物相继成功克隆,但其克隆效率很低（低于10％）以及大都表现出不同程度的器官衰竭或发育畸形等。猪体细胞核移植在异种器官移植和克隆性治疗上具有重大意义,但其克隆效率更低（1%-2％）。利用胞质注射技术对比不同供核细胞、是否经血清饥饿和不同时间段激活对重构胚发育的影响,在其重构胚卵裂率上,试验结果表明：颗粒细胞与胎儿成纤维细胞无显著差异（43．37％,45．98％;P〉0．05）;血清饥饿与否无显著差异（45．61％。50．71％;P〉0．05）;在核移植后1-3h和3-5h激活显著高于立即激活（51．82％,56．98％。8．51％;P〈0．05）。     

牛体细胞核移植技术体系的优化

为了提升卵母细胞成熟质量和核移植胚胎的体外发育潜能,在卵母细胞成熟液和胚胎培养液中分别添加不同浓度IGF及胎牛血清FBS,并探讨了二者对牛卵母细胞成熟培养、核移植胚胎发育的影响以及相关性能的变化。结果表明:分别在成熟液中添加40 ng/mL IGF、培养液中添加20%FBS后,成熟率、卵裂率、囊胚率均有显著提高。本研究为今后牛体细胞核移植技术体系的优化和完善打下了坚实的理论基础。     

不同类型供体细胞对牛体细胞重构胚发育能力的影响

(1西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵 712100;2陕西省畜牧兽医总站,陕西西安710016)     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

本试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组：80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组：75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组：70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组：85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组：75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组：70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组：80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组：70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组：60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106 /mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明：BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24 h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

LIF与心肌条件液在小鼠ES细胞分离中的差异比较

通过比较LIF和大鼠心肌条件液在小鼠ES细胞分离培养过程中的差异, 从而选择较为合适的培养液用于小鼠ES细胞的分离培养与深入研究。取怀孕3.5 d小鼠囊胚, 培养于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上, 然后根据ES细胞培养液的不同分成2组,一组添加LIF的ES细胞培养液,另一组添加由大鼠心肌条件液组成的ES细胞培养液。结果显示,小鼠ICM的孵出率在心肌条件液中为76.30 %, LIF条件液中为59.35 %,两者差异极显著(p＜0.01)))))) ; 在LIF条件液中比心肌条件液中能较早地分离出ICM,时间差分别为11、11、12、10和12 h,平均为11.2 h; 对传代的ES细胞集落,培养48 h时周边出现分化现象的ES细胞集落所占的比例在心肌条件液中为51.55%, LIF条件液中为31.69 %,两者差异显著(p＜0.05); 第五代小鼠ES细胞核型正常率在心肌细胞条件液中为78.6 %, 稍高于LIF条件液中的76 %,差异不显著。     

梅花鹿鹿茸真皮层细胞的分离培养及冷冻保存

为了研究梅花鹿鹿茸真皮层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端的真皮层组织,分离真皮层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明,在含10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸真皮层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈长梭形或菱形,细胞的生长状况良好,传代培养的细胞培养5d可长至汇合。传4代以前的细胞形态均一,边缘光滑,胞质均匀透明,细胞排列紧密;传5代后,细胞伸展变为扁平形,细胞突起增多,边缘不光滑,汇合后细胞排列疏松。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,真皮层细胞复苏后的存活率较高。     

影响克隆牛生产效率之因素研究

为了提高牛体细胞克隆的效率,比较了不同融合电压对核移植胚发育的影响,其中1.7kv/cm电场强度,获得了较高的融合率、卵裂率和囊胚率,分别为67.14%,76.59%和29.16%。比较了血清饥饿处理体细胞对核移植效率的影响,血清饥饿处理体细胞后,融合率、卵裂率和囊胚率分别为68.91%,74.79%和28.26%,与非血清饥饿处理的相比没有明显差异(分别为60.96%,71.91%和20.31%,P>0.05)。而且胚胎移植后的怀孕率和产犊率也没有差异(分别为29.17%,8.33%和33.33%,16.66%,P>0.05)。另外,通过加强克隆牛的产后护理,可以提高克隆牛的成活率。总之,优化生产克隆牛的各环节因素,可以从整体上提高克隆牛的生产效率。