杀线虫解淀粉芽胞杆菌Sneb709与费氏中华根瘤菌Sneb183共培养发酵条件优化

根结线虫可引起作物发生严重的土传病害,生物防治是持续控制此类病害的有效措施。本实验室前期筛选获得多株杀线虫活性的芽胞杆菌和根瘤菌,本研究将解淀粉芽胞杆菌Sneb709与费氏中华根瘤菌Sneb183进行共培养后发现,共培养发酵液对南方根结线虫2龄幼虫J2活性显著提高,因此本文利用响应面法对其发酵条件进行优化,获得更好的生防效果。以J2的校正死亡率为指标,采用单因素法、最陡爬坡法和响应面法设计并优化共培养菌株的发酵液培养基成分以及培养条件,确定共培养发酵液的最适培养基成分为：山梨糖1.98 g/L、黄豆粉1.06 g/L、花生饼粉2.08 g/L;最佳发酵条件为：温度30.4℃、初始pH 6.49、装液量103.15 mL。使用优化条件对两个菌株进行共培养后,其发酵液对J2的毒杀活性显著提高,提升至84.17%,使用发酵罐验证,共培养发酵液的毒杀活性提升了24.72%。该结果为共培养菌株有效的活性产物分离提取等后续研究及杀线虫生防菌的产业化提供了理论依据。     

防治南方根结线虫的根瘤内生细菌的筛选及鉴定

根结线虫的严重发生给农作物生产造成巨大经济损失，生物防治是控制该病的一种安全有效措施。本研究从448株根瘤内生细菌分离株中筛选出3株对南方根结线虫有较好防效的生防细菌Sneb1994、Sneb1995和Sneb2000，3个菌株发酵滤液对南方根结线虫2龄幼虫（J2）均有高毒杀活性，处理24 h校正死亡率达85%以上，同时对卵孵化具有抑制作用，并可促进番茄种子生长。盆栽试验结果表明，3个菌株发酵液灌根处理均能显著减少根结数和卵囊数，相对防效为37.95%~44.51%，同时促进番茄植株的生长。经形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鉴定菌株Sneb1994、Sneb1995和Sneb2000分别为氧化微杆菌Microbacterium oxydans、油菜假单胞菌Pseudomonas brassicacearum和蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。氧化微杆菌为首次报道对根结线虫有效的生防菌株。这些根瘤内生细菌菌株的发掘，为植物线虫病害的生物防治提供了新的微生物资源。     

生防链霉菌JH108-2的发酵培养基优化

 为了提高链霉菌菌株JH108-2的发酵滤液对植物寄生线虫的毒力,采用正交试验设计,优化其发酵培养基。使用优化培养基[大豆粉20g、(NH₄)₂SO₄ 6g、蛋白胨3g、葡萄糖40g、酵母粉6g,NaCl 2g、K₂HPO₄ 0.6g.CaCO₃ 2g、蒸馏水1000mL、pH 6.0]所得的发酵滤液,稀释10倍,处理南方根结线虫(Meloidogyne incognita)二龄幼虫,24h后校正死亡率达95.4%,比对照培养基的发酵滤液所产生的校正死亡率高6.9%,差异达到极显著水平(P=0.01)。     

石榴枯萎病菌拮抗放线菌对南方根结线虫的毒力

从云南蒙自万亩石榴园、建水石榴园采集的土样中分离筛选得到对石榴枯萎病菌有较强拮抗活性的放线菌,其中菌株JS1对石榴枯萎病菌的室内抑菌半径为11mm。测定了菌株JS1发酵液对南方根结线虫的抑杀活性,结果表明,50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫卵6d,卵孵化率与对照相比降低了51.67%;50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫2龄幼虫72h,2龄幼虫的校正死亡率增加了88.10%;菌株JS1兼有拮抗石榴枯萎病菌及抑杀南方根结线虫的活性。结合菌株JS1在鉴定培养基上的培养特征、形态学观察及16SrDNA序列分析,将JS1初步鉴定为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)。     

里西裸囊菌za-130的杀线活性及其影响因素

本文测定了里西裸囊菌Gymnoascus reessiiza-130菌株发酵滤液对南方根结线虫Meloidogyne incognita2龄幼虫的毒杀活性,研究其对分散卵及卵囊孵化的影响及影响因素。结果表明,za-130菌株发酵滤液处理24h和浓缩5倍滤液处理2h后对南方根结线虫2龄幼虫致死率均达到100%;发酵滤液处理3d和10d对分散卵的孵化抑制率均高于87%,对卵囊的孵化抑制率均高于95%;这些均与1μl/ml 1.8%阿维菌素乳油和33μg/ml 10%福气多颗粒剂效果相当。发酵滤液中杀线活性物质具有一定的抗热性、耐pH（1.0~9.0）、抗紫外（照射低于6h）和日光灯照射的能力。     

粉红螺旋聚孢霉NF-06固体发酵条件优化及对南方根结线虫的防治效果

南方根结线虫是一种严重危害我国蔬菜安全生产的土传病害，生产上亟需一种有效的防控方法。本研究从根结线虫卵囊中分离到一株生防真菌NF-06，通过形态学和分子生物学方法将其鉴定为粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea。通过离体活性测定的方法测定NF-06发酵滤液对根结线虫2龄幼虫的致死作用，发现24、48和72 h后2龄幼虫的相对死亡率分别达63.6%，75.5%和87.0%。以产孢量为指标，优化菌株NF-06固体发酵条件，确定最佳基础培养基为麦麸和麦秸秆混合物，其比例为4：1（wt/wt），在基础培养基中添加10%玉米粉、2%蚕豆粉和0.05% KH₂PO₄可获得最大产孢量；最优培养条件为初始pH值7.0，初始含水量40%，接种量5%，产孢量达8.9×10¹⁰ CFU/g。室内盆栽防治效果测定显示，菌株NF-06固体发酵物能够有效降低土壤中的线虫数量和番茄根结指数，其中5 g/株穴施处理的线虫减退率和防治效果分别达67.9%和69.6%。本研究为生物杀线虫剂的开发和利用提供理论依据。     

杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定

自烟草中分离获得对南方根结线虫Meloidogyneincognita具有较高杀线活性的拮抗细菌菌株YC-10。研究发现该菌株有伴胞晶体产生,菌体、芽胞形态及生理生化特性与苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种B．thuringiensissubsp．kurstaki相似,16srDNA序列分析表明其与苏云金芽胞杆菌相似性最高,初步确定该菌株为苏云金芽胞杆菌。菌株发酵液及伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2有很强的杀线活性,发酵液处理南方根结线虫,24h线虫死亡率为100％;伴胞晶体蛋白处理南方根结线虫,24h的LC50为5．86μg．mL^-1。研究结果显示该菌株在线虫生物防治上有较大的应用潜力。     

根结线虫拮抗放线菌菌株DA07118的筛选与鉴定及其发酵条件的优化

从海南东寨港红树林、尖峰岭等原始森林及黄流地区发病蕉园采集土壤样品,分离得到215株放线菌菌株。以根结线虫为靶标线虫对215株放线菌进行筛选,获得18株对根结线虫校正死亡率在80%以上的菌株。菌株DA07118抗线虫活性最强,校正死亡率达100%;经5次继代培养,仍具有稳定产生杀线虫活性物质的能力。通过形态学、生理生化反应和16S rDAN分类鉴定,将该菌株归类为链霉菌属Streptomyces。进一步的发酵条件优化试验,确定该菌株产活性物质的最佳培养基配方为（g/L）：麦芽糖10g、蔗糖25g、酵母膏20g、蛋白胨20g、K2HPO4 0.5g,初始pH7.0。发酵优化后,菌株发酵液的10倍稀释液处理后24h对根结线虫的校正击倒率从优化前的75.0%提高到93.7%。     

水稻拟禾本科根结线虫生防细菌的分离鉴定与防治效果评价

为获得对水稻拟禾本科根结线虫具有较高杀线虫活性的生防细菌,初筛以马铃薯腐烂茎线虫、复筛以拟禾本科根结线虫2龄幼虫为靶标线虫,采用直接触杀法对土壤分离细菌进行筛选。获得8株具有较高杀线虫活性的菌株,其中D45菌株发酵液的杀虫活性最好。其发酵液上清5倍稀释液处理24、48 h后,马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫2龄幼虫的死亡率分别为69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。盆栽试验和田间试验表明,在拟禾本科根结线虫侵染前采用D45菌株发酵液进行土壤处理,可显著减少水稻根结数。D45高活性菌株产生的杀线虫物质对蛋白酶稳定,但不耐热和酸。经生理生化测定结合16S rRNA基因序列分析,D45菌株为巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium。D45菌株对防治水稻拟禾本科根结线虫具有应用潜力。     

生防细菌YC-10的杀线虫活性及其鉴定

 从烟草中分离出1株对根结线虫和胞囊线虫有较高生物活性的内生细菌菌株-YC-10。将该细菌发酵滤液原液及5、10、20和40倍稀释液处理南方根结线虫,96 h后线虫死亡率均达到100%,处理大豆胞囊线虫96 h,致死率大于90%,在植物线虫生物防治上显示出巨大的应用前景。通过形态特点、理化特征以及16SrDNA序列同源性分析将菌株YC-10鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。对发酵液活性成分理化性质研究表明,活性成分对热稳定,高温、蛋白酶K处理不影响其杀虫活性,而酸性条件下杀线虫活性比碱性中更强。为后续杀线虫活性成分的分离及杀线虫机理研究奠定基础。      

假格里尼翁苍白杆菌A-29对南方根结线虫的防治效果及其鉴定

南方根结线虫是一种重要的植物寄生线虫，严重发生时可造成巨大的经济损失。本研究测定了菌株A-29发酵液对南方根结线虫的致死效果和盆栽防效，并对其进行了种类鉴定。结果表明，菌株A-29发酵滤液原液、5倍液和10倍液处理南方根结线虫后，2龄幼虫的致死率在24 h和48 h后达71.09%～95.45%，卵的孵化抑制率4 d时为59.25%～87.86%，其死亡率随处理浓度的提高而增加；菌株A-29发酵液处理60 d后对番茄根结线虫的防治效果达75.00%，番茄植株鲜重、根系干重和植株高度分别增加38.41%、33.52%和20.01%；根据菌株A-29的形态特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系统发育关系，将其鉴定为假格里尼翁苍白杆菌Ochrobactrum pseudogrignonense。研究表明，菌株A-29不仅对南方根结线虫具有良好的致死效果，而且对番茄植株具有明显的促生作用，是一株具有应用前景的生防菌。     

菌株S01324对燕麦孢囊线虫的杀线活性及其种类鉴定

 燕麦孢囊线虫是我国小麦孢囊线虫病的重要病原之一,为寻找适宜的生防菌株,本研究通过室内生测、室内杯栽试验以及田间管栽试验对菌株S01324的菌体和发酵滤液进行了杀线虫活性测定。室内生测结果发现,菌株S01324对孢囊的寄生率达到100.0%;处理8 d后,菌株发酵滤液原液对卵孵化的抑制率为98.8%,发酵滤液稀释16倍对卵孵化的抑制率仍能达到42.0%;处理24 h后发酵滤液原液对二龄幼虫(J2)的校正死亡率达到100.0%,而处理6 d后发酵滤液8倍稀释液也能杀死全部J2。杯栽试验发现,发酵滤液原液和麦粒培养物处理后,孢囊减少率分别为50.6%和62.1%。管栽试验发现,发酵滤液原液和麦粒培养物处理后,孢囊减少率分别为60.8%和58.9%。通过形态学和序列分析,菌株S01324鉴定为绳状青霉(Penicillium funiculosum)。这是关于绳状青霉杀线活性的首次报道。     

响应面法优化根结线虫生防真菌Snef5的发酵工艺

为提高生防真菌Simplicillium chinense Snef5的杀线虫活性,本研究采用响应面法对其发酵条件进行优化。首先,采用Plackett?Burman法筛选出有显著效应的3个因素：初始pH值、蔗糖和MgSO₄·7H₂O用量,而后通过Box?Benhnken设计和响应面分析法对其进行分析,获得了优化的最佳初始pH值为6.74,蔗糖含量4.19%,MgSO₄·7H₂O含量0.04%。经摇瓶和发酵罐发酵验证,该理论预测值与实测值无显著差异;优化后的发酵液杀线虫活性与原始发酵液相比,摇瓶发酵与30 L发酵罐产出的发酵液对南方根结线虫2龄幼虫的致死率分别提高了20.6%和21.3%,显示出较好的优化效果。试验结果对生防真菌的发酵及实际应用具有重要指导作用。     

辽宁省大型真菌浸提液及发酵液对线虫的毒力作用

利用从辽宁省采集的206株大型野生真菌的浸提液和部分发酵液,测定其对根结线虫Meloidogyne incognita、胞囊线虫Heterodera glycines、小杆线虫Caenorhabditis sp.和水稻干尖线虫Aphelenchoides basseyi的活性。结果表明：有22种真菌对靶标线虫的致死率达70%以上,且同一菌株的浸提液和发酵液对线虫亦有明显的选择毒性作用。有7株菌浸提液对2种以上靶标线虫的致死率超过90%。蛇头菌Mutinus caninus F149浸提液对南方根结线虫毒力最高,致死率达97.74%,对胞囊线虫和水稻干尖线虫的毒力也超过90%,而对小杆线虫毒力仅为24.04%,因其对人毒性大而未获得纯培养。薄蜂窝菌Hexagonia tenuisF128浸提液对大豆胞囊线虫J2毒力最高,致死率达96.55%,但其发酵液毒力下降;浸提液对根结线虫的毒力仅次于F149,对水稻干尖线虫毒力较弱,但发酵液对干尖线虫致死率却提高至91.38%。块鳞青鹅膏Amanita excelsaF155浸提液对根结线虫的致死率达96.67%,但发酵液仅为70.93%。粉迷孔菌Daedalea biennis F139的浸提液对小杆线虫的毒力最强,致死率达90.40%。松生拟层孔菌Fomitopsis pinicola F130的浸提液与裂褶菌Schizophyllum commune F107的浸提液和发酵液及小灰孢Lycoperdon pusillus F102的发酵液对水稻干尖线虫的致死率均超过95%。血红菇Russula sanguinea F204和大红菇R.alutacea F153的浸提液和发酵液对3种植物线虫的致死率均超过85%,而对小杆线虫的毒力较弱。     

茶皂素杀线虫活性测定分析

 茶皂素(Tea saponin, TS)是由各类茶籽(油茶Thea sinesis或茶Camellia sasauqua)饼粕中提取出来的五环三萜类化合物,具表面活性、生理活性和鱼毒活性以及溶血性等。近10年来,国内有关TS杀虫抑菌活性有较多的研究报道,但未见杀线虫活性方面的报道。     

淡紫紫孢菌微菌核发酵滤液生防活性及代谢组学分析

淡紫紫孢菌是一种重要的生防真菌,在特定培养条件下可产生抗逆结构-微菌核。本文通过室内生测和温室盆栽试验,研究了淡紫紫孢菌微菌核发酵滤液对植物病原菌和根结线虫的抑制作用。结果表明,微菌核发酵滤液具有较强的杀线抑菌活性,其中对核盘菌生长抑制率达到70.5%,并显著降低菌核数量,滤液稀释10倍后对根结线虫二龄幼虫的致死率达到50%以上。用量为10 mL/株时对根结线虫病防效达到44.9%,黄瓜株高和茎粗分别增加21.6%和38.4%。同时,基于LC-MS构建了淡紫紫孢菌微菌核培养代谢组。分析表明,微菌核形成过程中芥酸、胡椒酚和泛酸等抑菌物质以及丁酸、咪唑乙酸等杀线化合物相对含量显著增加。本研究为揭示淡紫紫孢菌生防机制奠定了基础,为微菌核制剂的研发提供了理论依据。     

来源于中药的稻瘟病菌拮抗解淀粉芽胞杆菌鉴定及其活性成分特性

为寻找新的水稻稻瘟病拮抗微生物资源,本研究从中药提取液中分离纯化到一株性能优良的拮抗细菌CWJ2。平板对峙试验显示该菌株对水稻稻瘟病菌丝生长抑制率为69.51%。根据菌落、菌株形态、16S rDNA和gyrB基因序列,鉴定该菌株为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。该菌株发酵滤液能明显抑制稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发,10%的发酵滤液能100%抑制菌丝生长;2%的发酵滤液能导致菌丝分支明显减少,菌丝变短、膨大或畸变。菌株CWJ2的发酵液在高温、蛋白酶K、紫外和酸碱处理下,抑菌活性无显著变化。试验结果表明,菌株CWJ2对稻瘟病菌拮抗效果好,且抗菌活性成分稳定,有望作为生防菌株开发防治稻瘟病制剂。