紫杉二烯合成酶基因转化红豆杉内生真菌XT5的研究

[目的]研究紫杉二烯合成酶基因转化短叶红豆杉（Taxus brevifolia）内生真菌XT5的情况。[方法]采用土壤农杆菌介导法将来自红豆杉中的紫杉二烯合成酶基因转入红豆杉内生真菌XT5中,研究紫杉醇发酵产量。[结果]成功转化得到8株重组子,其中XT5-TS-2的紫杉醇含量得到了大幅提高,其最高产量为423.983 4μg/L,比原始菌株提高了53.19%,表明转化紫杉二烯合成酶基因能够有效提高紫杉醇产量。[结论]该研究可为提高红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇产量提供理论支持。     

红豆杉细胞中的酚类化合物含量与紫杉醇产量之间的关系

研究了在真菌诱导子诱导红豆杉细胞时酚类化合物与紫杉醇产量之间的关系。结果表明：真菌诱导子处理提高了细胞的G6PD、PAL的活性和酚类化合物含量;真菌诱导子和谷氨酸的联合处理也可提高细胞中G6PD、PAL的活性,且联合处理后的酶活性较真菌诱导子单独处理的要高。联合处理后紫杉醇产量与酚类化合物的变化相似,均是前期低于真菌诱导子处理,后期高于诱导子处理;PAL的抑制剂AOA显著降低真菌诱导子处理的酚类化合物和紫杉醇的产量,同时细胞死亡明显增加。因此认为,酚类化合物与细胞诱导时的紫杉醇产量有关,细胞诱导时保持一定浓度的酚类化合物有利于紫杉醇产量的提高。     

产紫杉醇内生真菌O60B1的分离及鉴定

从曼地亚红豆杉(Taxus x media)树皮内表皮中分离得到1株产紫杉醇的内生真菌O60B1,并通过高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)分析其发酵产物,其紫杉醇产量为2.5～3.0 μg/g(紫杉醇/菌丝干重),并通过形态学特征和18 S rDNA序列分析,将其初步鉴定为毛霉属(Mucor sp.)真菌.     

生长调节剂对红豆杉内生真菌产紫杉醇的影响

根据紫杉醇的结构特点和红豆杉中紫杉醇的合成机制,选取4种生长调节剂,研究其对红豆杉内生真菌合成紫杉醇的影响。结果表明,在发酵过程的第10天,补加下列任一生长调节剂,使发酵液中初始浓度分别达到水杨酸20.0 mg/L,茉莉酸甲酯100.0μmol/L,赤霉素2.0 mg/L,矮壮素2.0 mg/L,均能提高紫杉醇产量。同时,在发酵过程的第10天补加蔗糖,在含量不高于15 g/L时,对紫杉醇的积累和菌丝体生长具有促进作用,但是高于此浓度时,菌丝体生长受抑制,紫杉醇含量降低。     

红豆杉中产紫杉醇及其类似物内生菌的分离与筛选

为了从红豆杉中分离筛选可以产紫杉醇及其类似物的内生菌，本研究以红豆杉为试验材料，对其针叶和枝条通过划线分离法共筛选得到9株内生菌，对所得菌株用不同发酵培养基进行摇瓶发酵培养，发酵液及菌体经乙酸乙酯萃取浓缩后以紫杉醇标准品为对照进行薄层层析（TLC）检测。试验发现9株内生菌中有4株可以产生紫杉醇及其类似物，其中内生真菌有3株，内生细菌有1株。通过细菌16S rDNA扩增测序和真菌Its扩增测序分析可知，3株内生真菌初步确定为1株链格孢菌（Alternaria sp.）和2株Paraconiothyrium brasiliense,1株细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）；相同菌株用不同发酵培养基时，样品Rf值不同，表明培养基成分会影响菌体进入次级代谢的时间，并进一步影响前体物质向紫杉醇的转化。试验结果为后续紫杉醇这一天然中药成分的生物合成及其代谢调控奠定了基础。     

中国红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离与鉴定

为了开发生产紫杉醇的新途径,以中国红豆杉根、茎、叶为试验材料,对其中产紫杉醇的内生真菌进行分离和鉴定。结果表明:从中国红豆杉中共分离出10株内生真菌,在PDA液体培养基中发酵后经薄层层析法检测,出2株能够产生紫杉醇,对产紫杉醇的菌株进行形态学鉴定表明,其中一株为青霉属,另一株为芽枝霉属。     

药用植物内生真菌研究进展

药用植物内生真菌具有丰富的多样性;可以产生与宿主相同、相似或在医药、农业、工业等行业有重要应用价值的活性物质;通过与药用植物的共生关系对某些药物的形成具有重要作用。目前已研究过内生真菌的药用植物至少有145种。综述了产紫杉醇的药用植物和其他药用植物内生真菌的研究进展。     

南方红豆杉紫杉醇产生菌的分离与鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)根部树皮内表皮中分离得到69株内生真菌,通过HPLC检测发酵液中紫杉醇含量,共获得7种紫杉醇产生菌,同时,通过形态学分析以及ITS序列分析确定分别属于链格孢属(Alternaria)、葡萄孢盘菌属(Botryotinia sp.)、刺盘孢属(Colletotrichum)、拟茎点霉属(Phomopsis)和枝孢菌(Cladosporium),其中链格孢属真菌紫杉醇产量最高,平均为271.54μg/L,是目前见诸报道的产量最高的链格孢菌,亦是从红豆杉根部树皮中筛选出的紫杉醇产量较高的野生菌株之一。该菌株的发现为紫杉醇高产菌的选育提供了又一优良的种质资源。     

深色有隔内生真菌对番茄种植土壤的改良效果研究

土壤质量对作物产量和品质有直接影响。深色有隔内生真菌广泛存在于自然环境中,其可以通过与植物根系的相互作用,提供多种益生效应。试验通过分析深色有隔内生真菌对番茄种植土壤养分、孔隙度、菌落数的影响,研究深色有隔内生真菌对番茄种植土壤的改良作用。试验结果表明,深色有隔内生真菌对番茄种植土壤养分、孔隙度、菌落数有明显影响,施用深色有隔内生真菌可提高土壤有效氮、有效磷、有效钾等质量分数,提高土壤孔隙度,以及减少土壤中菌落数量。这说明深色有隔内生真菌能够有效改良番茄种植土壤,进而提高作物产量和品质,有助于农业可持续发展目标的实现。     

濒危植物杜仲内生真菌及次生代谢产物活性研究进展

杜仲是我国特有的濒危药材,研究表明内生真菌可以产生与宿主相同或相似的活性物质,利用杜仲内生真菌解决杜仲资源缺乏的问题具有较深远的应用前景。本研究较系统地阐述了近年来杜仲内生真菌的多样性、次生代谢产物和提高内生真菌活性代谢产物产量的技术和方法,提出了研究中亟待解决的问题,以便为濒危植物杜仲资源的保护、开发和利用提供理论依据。     

中国红豆杉内生真菌的分离鉴定及其产紫杉醇的特性

为筛选出微生物工业化发酵生产紫杉醇类药物的优良菌株,采用高效液相色谱(HPLC)及液质联用(HPLC-MS)等方法,对秦巴山区中国红豆杉进行了内生真菌的分离鉴定及其紫杉醇含量测定。结果表明:分离到1株内生真菌(H-21),为极细孢枝孢霉(Cladosporium tenuissimum);其代谢产物中存在紫杉醇,含量为163.5μg/L。     

产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备与再生

以产紫杉醇内生真菌XT5为供试菌株, 研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、菌体培养方式、菌龄等因素对产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备和再生的影响. 结果表明: 将内生真菌XT5在PDA液体培养基中静止培养12～16 h, 离心收集菌体, 用0.7 mol/L的NaCl配制成的含有2%纤维素酶+1%蜗牛酶的复合酶, 32 ℃恒温酶解2 h, 原生质体制备率最高;以上述条件酶解1.5 h左右, 采用双层平板培养法于32 ℃再生, 获得的原生质体再生率最高为12.4%.     

南方红豆杉内生真菌Bionectria sp.的分离、鉴定及代谢产物活性研究

从南方红豆杉树皮中分离到30株内生真菌,结合形态学和ITS-5.8S rDNA序列两种鉴定方法,确定其中1株(XH004)为生赤壳属(Bionectria)真菌,这是目前世界上首次从红豆杉科植物中分离到该属内生真菌.通过抑菌实验、细胞毒实验、TLC检测和HPCL检测证明XH004代谢产物具有明显的抗菌和杀细胞作用,且极可能含有紫杉醇或紫杉醇类似物.     

南方红豆杉内生真菌Bionectria sp.的分离、鉴定及代谢产物活性研究

从南方红豆杉树皮中分离到30株内生真菌,结合形态学和ITS-5.8S rDNA序列两种鉴定方法,确定其中1株（XH004）为生赤壳属（Bionectria）真菌,这是目前世界上首次从红豆杉科植物中分离到该属内生真菌.通过抑菌实验、细胞毒实验、TLC检测和HPCL检测证明XH004代谢产物具有明显的抗菌和杀细胞作用,且极可能含有紫杉醇或紫杉醇类似物.     

钒酸钠对悬浮培养红豆杉细胞合成紫杉醇的影响

红豆杉细胞培养生产紫杉醇,是一种潜在的大规模生产紫杉醇的重要途径,然而和其它植物细胞培养一样,红豆杉细胞的紫杉醇含量较低等问题,限制着该技术的产业化进程。寻找提高和稳定紫杉醇产量的方法,是目前需要解决的主要问题。筛选合适的生物或非生物诱导子(如真菌培养物、茉莉酸甲酯、水杨酸、Cu2+、Ce4+、Ag+),提高细胞的紫杉醇产量,成为国内外研究的热点。     

丽江塔城地区云南红豆杉内生真菌的多样性研究

为了探悉云南红豆杉内生真菌的多样性,研究了云南丽江维西地区云南红豆杉(Taxus yunnanensisCheng et L.K.Fu)内生真菌的种类组成及数量。从云南红豆杉根、茎、叶中分离获得115种内生真菌,经过形态学和ITS分析结果表明,这115种内生真菌分属于21属,其中分布最广的类群是芽枝霉属(19种),其次是黑孢属(17种)和拟茎点霉属(14种),说明云南红豆杉不同部位内生真菌的数量、分布、种群及其组成存在差异,具有丰富的物种多样性。经初步检测,其中有4个菌种能够产生紫杉醇。     

前体物质对红豆杉内生真菌产紫杉醇的影响

根据紫杉醇的结构特点和红豆杉中紫杉醇的合成机制,选取了几种前体物质,研究其对红豆杉内生真菌合成紫杉醇的影响。结果表明,在发酵培养的第10天,补加下列任一前体物质,使发酵液中初始浓度分别达到苯甲酸钠30.0 mg/L,酪氨酸20.0 mg/L,L-苯丙氨酸3.0 mg/L,乙酸钠3.0 g/L,均能提高紫杉醇产量。进一步采用L_(16)(4~5)正交试验分析得到,4种前体物质在培养基中的最佳组合为A_3B_3C_3D_1,即L-苯丙氨酸3.0 mg/L,酪氨酸40.0 mg/L,乙酸钠3.0 g/L,苯甲酸钠10.0 mg/L,对应发酵液中紫杉醇含量达到987.3μg/L。     

一株产紫杉醇的曼地亚红豆杉内生真菌的分离及鉴定

[目的]分离并鉴定1株产紫杉醇的曼地亚红豆杉内的内生真菌.[方法]从曼地亚红豆杉树皮内表皮中分离得到32株内生真菌,并通过高效液相色谱法检测其发酵产物.[结果]筛选获得1株可以产紫杉醇的内生真菌M57,其紫杉醇产量为45～50μg/L,并通过对M57菌落的形态学观察以及18S rDNA序列分析初步将其鉴定为根霉属(Rhizopus)真菌.[结论]该菌株的发现为微生物发酵法生产紫杉醇提供了具有潜在应用价值新的菌种. Abstract： [Objective] The aim was to isolate and identify a taxol-producing endophytic fungus from Taxus media.[Method]32 strains of endophytic fungi were identified form the inner bark of T.media,and their fermentation products were detected by high performance liquid chromatography (HPLC). [Result] Through the screening,a strain of taxol-producing endophytic fungi M57 was obtained,which could produce 45-50 μg/L of taxol,and M57 was defined as Rhizopus sp.through morphological observation and 18S rDNA sequence analysis. [Conclusion] The finding of Rhizopus sp.M57 provided a promising strain for producing taxol with taxol-producing fungi fermentation process.     

产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备与再生

以产紫杉醇内生真菌XT5为供试菌株,研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、菌体培养方式、菌龄等因素对产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备和再生的影响。结果表明：将内生真菌XT5在PDA液体培养基中静止培养12-16h,离心收集菌体,用0．7mol／L的NaCI配制成的含有2％0纤雏素酶＋1％蜗牛酶的复合酶,32℃恒温酶解2h,原生质体制备率最高;以上述条件酶解1．5h左右,采用双层平板培养法于32℃再生,获得的原生质体再生率最高为12．4％．     

1株产紫杉醇内生真菌的原生质体制备与再生

对1株产紫杉醇的内生真菌的原生质体的制备与再生进行了研究.结果表明,原生质体制备的最佳条件是1.33%纤维素酶+2.66%蜗牛酶的酶解液,酶解时间6 h,稳渗剂为0.7 mol/L NaCl,酶解温度30℃,酶解pH值6.0,原生质体产量524万个/mL,原生质体细胞再生频率为21.47%.