甘蓝冷胁迫相关基因BobHLH18克隆与表达分析

利用同源克隆方法在耐寒,迟抽薹甘蓝自交系Y923中克隆到一个甘蓝响应冷胁迫b HLH转录因子基因Bob HLH18的DNA和c DNA全长,基因组搜索分析结果表明,该基因位于甘蓝1号染色体上,属于LF1亚基因组编码基因;序列分析结果表明,该基因含有4个外显子和3个内含子,编码338个氨基酸,蛋白质分子量为38 380,等电点为6. 80,其编码蛋白质的N端含有一个b HLH结构域;亚细胞定位分析指出该基因编码蛋白质定位在细胞核上,表明该基因编码蛋白质为核定位蛋白质,与其为转录因子特征相符;序列比对结果显示,Bob HLH18蛋白与白菜和拟南芥中的b HLH蛋白具有较高的同源性,相似度分别为90. 5%和89. 0%;聚类分析指出Bob HLH18及其同源蛋白分别聚类成2个进化分支,且来自十字花科植物的b HLH18同源蛋白质都聚在同一进化分支上; qRT-PCR分析结果表明Bob HLH18基因受冷胁迫诱导,能在叶片中被较高的诱导表达,表明该基因可能在甘蓝叶片应答冷胁迫过程中起重要作用。     

陆地棉GhWOX4转录因子的克隆与生物信息学分析

采用反转录PCR(简称RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个WOX基因,命名为Gh WOX4(NCBI登录号:KX900572)。序列分析显示,Gh WOX4的开放阅读框为657 bp,编码含218个氨基酸残基的蛋白,具有典型高度保守的同源异型HD结构域,属于WOX转录因子家族。生物信息学分析表明,该基因蛋白相对分子量为25.19 ku,等电点为10.04,为不稳定蛋白。二级结构以无规则卷曲为蛋白最大量的结构元件。与其他植物同源基因序列比对显示,其同源区域主要集中在同源异型HD结构域。系统进化树分析表明,Gh WOX4属于Ⅰ类家族成员,与陆地棉Gh_D01G1055、拟南芥At WOX4和可可树Tc WOX4等亲缘关系最近,处于同一个进化分支,推测其可能与之前报道的拟南芥WOX基因类似,参与植物维管束及花器官发育。     

小麦转录因子TabHLH041基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从小麦品种辽春10号中克隆得到1个b HLH转录因子基因Tab HLH041,并对其表达特性进行分析,以期为研究b HLH转录因子在小麦发育中的功能奠定基础。结果表明,Tab HLH041c DNA开放阅读框(ORF)长1 179 bp,编码392个氨基酸,Tab HLH041蛋白在C端含有1个b HLH结构域;该基因包括4个外显子和3个内含子。系统发育分析发现,Tab HLH041蛋白与大麦b HLH蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,总体上该基因的表达具有昼夜节律性,在光照条件下表达量呈下降趋势,在黑暗条件下表达量呈上升趋势。在低温条件下,Tab HLH041基因的表达呈现前期被诱导、后期被抑制的特征,处理24 h时低温的抑制作用最明显;在高盐、外源ABA和干旱处理条件下,Tab HLH041基因的表达持续受到抑制。综上,Tab HLH041基因可能参与光周期及逆境胁迫的信号转导途径。     

木薯25个WRKY家族转录因子在生物胁迫下的表达分析

根据拟南芥和水稻的WRKY基因和木薯基因组序列,利用生物信息学方法预测木薯Me WRKY转录因子家族成员,并对其进行系统进化关系和保守结构域的分析。通过病原菌接种处理,分析不同Me WRKY转录因子的表达差异。结果显示,木薯共编码25个与抗病相关WRKY蛋白,在病原菌胁迫条件下,其中16个Me WRKY基因的表达受到显著影响,表明这些WRKY蛋白可能参与木薯的防御应答反应。     

陆地棉转录因子Gh WRKY70的克隆及表达分析

【目的】棉花是一种重要的经济作物,雄性不育材料的创造和不育相关基因的挖掘一直是棉花育种工作的热点,Gh WRKY70基因的克隆和表达分析为该基因功能的研究奠定了基础。【方法】根据转录组测序结果,利用Primer 5设计GhWRKY70转录因子全长引物,q-PCR验证Gh WRKY70基因在不育和可育花药中的表达差异。【结果】克隆到Gh WRKY70基因全长为918 bp,定名为Gh WRKY70,Gene Bank号为MF278614。该基因编码的蛋白包含1个典型的WRKY结构域,每个WRKY结构域的C端含有1个C2HC类型的锌指蛋白结构。【结论】同源性分析表明,Gh WRKY70属于III类WRKY蛋白,与亚洲棉和可可的WRKY70的亲缘关系最近。转录因子GhWRKY70在洞A不育花药和可育花药中差异表达,表明该基因可能与雄性不育相关。     

植物WRKY转录因子及其生物学功能研究进展

WRKY转录因子是一个大的植物转录因子家族。该转录因子家族最显著的特征是家族各成员至少包含一个WRKY结构域,该结构域的N-端有一个高度保守的WRKYGQK基序,C-端为一个锌指类似结构域(zinc-finger-like motif),一般组成为C-X_(4-5)-C-X_(22-23)-H-X-H。WRKY转录因子通过WRKY结构域与下游目标基因启动子区的W-box进行特异性结合从而调控目标基因的表达。研究表明,WRKY蛋白除了广泛参与植物种子萌发与休眠、叶片衰老、代谢、激素信号转导外,还参与生物和非生物胁迫等生理生化反应过程的调控等新功能。综述了国内外有关WRKY转录因子的研究进展,讨论了其在植物生长发育以及应对生物和非生物胁迫过程中发挥的调控功能,以期为全面研究WRKY转录因子家族的结构和功能提供新的观点。     

谷子MYB转录因子家族与抗旱关系的研究

[目的]MYB蛋白家族是一类含有MYB保守结构域的转录因子,广泛参与调控植物生长发育及抗逆等多种生理反应。为探究抗旱作物谷子的抗旱性与MYB转录因子家族基因关系,从而为谷子特有抗旱基因资源的发掘及谷子抗旱分子机制的研究提供参考。[方法]本研究以抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF)为研究对象,在苗期PEG处理条件下,取叶片进行转录组测序,进而对有差异表达的MYB转录因子家族基因进行生物信息学分析。[结果]研究表明,26个MYB转录因子基因在GG和JF两个谷子品种中表现出较为明显的表达差异;且对应启动子区域的抗旱相关调控元件也呈现出差异的组成与分布;抗旱品种GG中明显上调的3个MYB调控基因(Si034363m、Si003539m、Si030711m)与拟南芥中主要参与抗逆的MYB转录因子存在较近亲缘关系。[结论]基于对谷子MYB转录因子的研究,推测26个表达差异的MYB类转录因子基因可作为谷子抗旱的重要候选基因,可为后续谷子抗旱分子机制的研究提供理论依据。     

桑树WRKY转录因子的全基因组鉴定及生物信息学分析

[目的]明确桑树基因组中WRKY转录因子家族结构及其功能特征,为进一步揭示WRKY转录因子家族生物学功能提供科学依据.[方法]利用生物信息学方法对桑树WRKY转录因子的数目、类型、结构、系统进化关系、保守结构域和密码子使用偏性等进行全面分析.[结果]基于桑树全基因组蛋白数据库,共鉴定出55个桑树WRKY转录因子家族基因,占桑树基因总数(29261)的1.88%.桑树WRKY转录因子存在6种内含子数量类型及15种内含子相位类型,其中27个基因含有2个内含子,25个基因的相位类型为2-2型.保守结构域系统进化分析结果显示,桑树WRKY转录因子家族蛋白主要分为三大类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ),Ⅰ类可分为ⅠN和ⅠC两个亚组,Ⅱ类根据聚类情况又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe等5个亚组.桑树WRKY转录因子蛋白保守结构域分析发现有五类Motif的保守性较强,桑树WRKY转录因子蛋白中均包含C端Motif l,Ⅰ类蛋白同时含有N端Motif 3.桑树WRKY转录因子家族基因启动子区富含PBF(C2H2锌指因子)和AHL(拟南芥hook因子)元件.密码子使用偏性分析结果显示,桑树WRKY转录因子家族基因的有效密码子数(ENC)介于48.00~60.00,密码子第3位GC含量(GC3s)介于0.330~0.722,平均亲水性值(Gravy)均为负值;同义密码子相对使用度(RSCU)>1.000的密码子有29个,且以A(6个)或T(11个)结尾较G(4个)或C(8个)结尾的略多.[结论]桑树WRKY转录因子家族包含55个成员,内含子相位类型一致的同组成员可能来源于同一祖先基因,且与基因复制和基因组重排有关;蛋白序列高度保守,在植物抵御环境胁迫过程中发挥作用;基因密码子使用偏性较弱,主要受碱基突变选择压力影响.     

麻风树JcHDZ28基因克隆与功能分析

HD-Zip家族基因与植物的生长和对环境胁迫的抗性密切相关,被认为是作物改良的关键因子。在本研究中,我们通过RT-PCR技术从麻风树中克隆了1个HD-Zip家族基因,命名为JcHDZ28。JcHDZ28基因包含1个882 bp的开放阅读框,编码1个含有293个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析结果表明,JcHDZ28含有高度保守的同源结构域和亮氨酸拉链(LZ)基序。表达模式分析结果表明,JcHDZ28基因在种子中的相对表达量最高,且盐胁迫下调该基因的表达。亚细胞定位分析结果表明,JcHDZ28基因编码1个核定位蛋白。过表达JcHDZ28基因增加了转基因拟南芥对盐胁迫的敏感性,且在盐胁迫条件下,转JcHDZ28基因拟南芥叶片脯氨酸含量显著低于野生型拟南芥,相对电导率显著高于野生型拟南芥,非生物胁迫相关基因在转JcHDZ28基因拟南芥中的表达也显著低于在野生型拟南芥中的表达。本研究结果可以为进一步阐明HD-Zip转录因子基因JcHDZ28在麻风树生长发育和响应非生物胁迫中的功能提供理论依据。     

黄冠梨PbpNCED3基因的克隆与表达

【目的】克隆黄冠梨Pyrus bretschneideri ‘Xuehuali’×P. pyrifolia ‘Shinsseiki’叶片中的9-顺式-环氧类胡萝卜素裂解双加氧酶(NCED)基因的全长cDNA序列,研究不同程度干旱条件下该基因的表达及与叶片内源脱落酸(ABA)的动态变化关系,为明晰该基因在梨树抗旱中的分子机理提供理论依据。【方法】根据转录组数据得到的PbpNCED3序列进行同源序列扩增,通过生物信息学分析确定其属于NCED家族基因。通过酶联免疫吸附法测定不同水分条件下梨叶片内源ABA的含量,通过实时荧光定量测定Pbp NCED3基因的表达量。【结果】Pbp NCED3cDNA序列全长为1 831bp,编码603个氨基酸(GeneBank登录号为:MH749461)。该蛋白具有NCED发挥功能所依赖的4个保守的组氨酸,有NCED家族特有保守结构域序列MIAHPKxDP和HDFAITE及RPE65结构域,N-端含有靶向叶绿体的转运肽。蛋白结构预测发现,该蛋白与玉米vp14(NCED家族蛋白)比对序列相似性为70%,且具有两亲性的α螺旋结构。PbpNCED3基因的表达量与梨叶片ABA的含量成正相关关系(相关系数为0.914),且二者都受到干旱的诱导。【结论】试验所得到的黄冠梨PbpNCED3属于NCED家族基因,该基因响应干旱胁迫,其表达量与内源ABA的含量动态变化趋势一致。     

棉花DNA甲基转移酶GhDMT9抗逆性分析

为探究GhDMT9基因的功能,深入了解DNA甲基转移酶在植物表观遗传方面的作用及其作用机制,利用PCR技术从陆地棉TM-1中克隆GhDMT9基因,构建p YL156:GhDMT9 VIGS沉默载体并侵染棉花;构建PBI121:GhDMT9过表达载体转染拟南芥。生物信息学分析结果为:GhDMT9蛋白质相对分子质量为57 691.44 k Da,等电点为5.45,总平均亲水性是-0.359,不存在跨膜结构域。GhDMT9是一种具有亲水能力的酸性稳定蛋白,不是分泌型蛋白,不能在细胞中发生迁移。二级结构预测显示含有α螺旋(29.61%)、无规则卷曲(45.29%)、延伸链(19.22%)、β-转角(5.88%)。干旱和盐胁迫处理VIGS沉默GhDMT9基因的棉花幼苗出现明显的表型差异。实时荧光定量PCR的表达模式分析结果表明:干旱和盐胁迫处理p YL156:GhDMT9侵染过的棉花与对照相比,GhDMT9的转录水平明显降低。干旱和盐处理转GhDMT9基因的拟南芥T3代幼苗叶片失水、发黄、长势较弱。棉花幼苗沉默GhDMT9基因后与对照相比耐盐性降低,过表达GhDMT9基因的拟南芥与野生型的拟南芥相比耐盐性降低。上述结果表明GhDMT9基因在棉花响应胁迫过程中发挥重要作用,为进一步研究棉花的抗逆机制,挖掘功能基因奠定基础。     

棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

【目的】棉花是重要的纤维作物,其生长常遭受非生物逆境危害,严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能,为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对,从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因,通过基因序列分析,发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板,根据EST序列设计引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析,并构建同源物种间系统进化树,通过SMART网站（http://smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料,在棉花15 d苗龄时（一对真叶期）,分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h,然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis,DPA）纤维等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221,和GAL4 DNA结合结构域载体,在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1 579 bp,开放阅读框为1 428 bp,编码475个氨基酸的蛋白,推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD,等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现,该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明,GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族,与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和MYB元件MBS1、MRE1、MRE3、MRE4亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明,GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达,其中,在叶中表达量最高,在根中表达量最低。在冷胁迫下,GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外,在1、6和12 h的表达量均低于0 h,呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下,GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h,但3、6和12 h的表达量均高于0 h,表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析,GhGT-2主要定位于细胞核中,转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现,GhGT-2可以结合GT元件。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列,其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域,属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下,GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。     

干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析

【目的】研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的功能,为其在果树抗逆基因工程改良中的利用奠定基础【方法】以‘壶瓶枣’（Ziziphus jujuba Mill. Hupingzao）结果枝构建的cDNA文库中选取一条与其他植物谷胱甘肽过氧化物酶基因有较高同源性的序列为研究对象进行序列分析,预测其功能。通过实时荧光定量技术分析目的基因在盐胁迫及干旱胁迫条件下的表达特性,并构建植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX,运用农杆菌介导法,将ZjGPX转入拟南芥,对转基因及野生拟南芥植株作盐胁迫及干旱胁迫处理,验证其抗逆功能。【结果】ZjGPX编码序列（CDS）长510 bp,编码169个氨基酸。Blast比对发现该基因与多种植物GPX基因具有高度同源性（>80%）。实时荧光定量分析表明,在辣椒枣组培苗中,ZjGPX能够被一定浓度的干旱胁迫和盐胁迫诱导表达,且反应迅速,仅胁迫15 min,其相对表达量与对照相比即出现大幅升高,暗示该基因可能对枣树抗旱性和耐盐性具有重要的作用。结合50 μg·mL^-1 Kan抗性筛选、PCR验证及激光共聚焦显微镜观察,共获得10株阳性转基因拟南芥株系,干旱及盐胁迫处理结果显示,转基因拟南芥种子萌发率均高于野生型拟南芥;成株在胁迫15 d后,野生型拟南芥出现叶片发黄、萎焉、整株干枯、死亡的迹象,而转ZjGPX拟南芥生长基本正常。表明过表达ZjGPX拟南芥株系具有良好的耐旱性和耐盐性。【结论】ZjGPX在植物的干旱和盐胁迫应答反应机制中起重要作用,过量表达ZjGPX可提高转基因拟南芥的耐旱和耐盐能力。     

棉花钠尿肽基因GhPNP1的耐旱功能分析

【目的】分析棉花中钠尿肽GhPNP1的结构特征、表达模式以及耐旱功能,并分析其耐旱机制,为将该基因应用于作物改良奠定基础。【方法】通过对从植物中水平转移到大丽轮枝菌中的钠尿肽基因AVE1进行同源性搜索,得到与AVE1蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5软件对AVE1蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEGA和expasy在线工具进行蛋白序列分析;并根据编码该蛋白的核酸序列设计引物在陆地棉品种奥3503中克隆到其同源基因GhPNP1。使用多种生物信息学软件分析GhPNP1的分子特性,包括GhPNP1编码蛋白的等电点、分子量、信号肽、进化关系等进行预测分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析GhPNP1在不同器官部位的组织表达模式以及受到PEG模拟干旱胁迫处理后的表达模式。将GhPNP1的cDNA序列连入CLCrV沉默载体中,构建GhPNP1的病毒诱导基因沉默载体CLCrV:GhPNP1,转入农杆菌,并通过和辅助载体CLCrVB共侵润2叶期幼苗进行叶片注射,获得GhPNP1的沉默植株。利用PEG模拟干旱处理沉默植株检测其耐旱性,并测定沉默植株的失水率、相对含水量、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化活性（T-AOC水平）、离子渗漏率等与植物抗逆相关的生理指标。【结果】从陆地棉奥3503中克隆到的GhPNP1的开放阅读框长度为396 bp,编码131个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,通过系统进化树分析GhPNP1编码的蛋白含有保守的钠尿肽结构域,与可可树的PNP蛋白进化关系最近。GhPNP1在棉花植株的根、茎、叶中均表达且在茎中表达量较高,PEG模拟干旱处理后根、茎、叶中的GhPNP1均上调表达。GhPNP1沉默后棉花植株耐旱性显著降低。在干旱条件下,GhPNP1沉默植株的MDA含量、离子渗漏率、叶片失水率均高于对照的未沉默植株;而沉默植株的总抗氧化能力（T-AOC水平）、相对含水量显著低于对照的未沉默植株。【结论】从棉花中克隆得到一个植物钠尿肽基因,受干旱胁迫诱导上调表达,沉默后耐旱性降低。推测GhPNP1可能通过cGMP信号途径参与棉花的干旱胁迫,在干旱胁迫下对棉花耐旱性起正调控作用。     

陆地棉GhbHLH4基因的克隆与功能分析

bHLH是一类存在于真核生物中的转录因子家族,其成员广泛参与到植物生长发育及抗逆过程之中。但是,在棉花中有关bHLH基因功能的研究报道不多。以陆地棉为材料分离克隆了GhbHLH4基因并对其功能进行了初步分析。结果表明：GhbHLH4基因启动子中含有大量与抗逆相关的顺式作用元件;转GhbHLH4基因的拟南芥植株与野生型相比叶片宽大、根系发达,转GhbHLH4基因植株能够耐受150 mmol/L NaCl并完成整个生长过程。研究结果为深入了解GhbHLH4基因耐盐的分子机理奠定了基础。     

陆地棉盐胁迫应答基因GhWRKY41的克隆与分析

为研究转录因子GhWRKY41在陆地棉盐胁迫应答过程中的作用,基于差减文库分析结果,利用RT-PCR和RACE技术,克隆了GhWRKY41基因(GenBank登录号为HM002635)。该基因cDNA长度为1 630bp,含有ORF(Open reading frame)为1 068bp,编码355个氨基酸的多肽,包含2个内含子。通过瞬时表达分析亚细胞定位,结果表明,转录因子GhWRKY41定位于细胞核,符合转录因子特性。转基因株系发芽试验结果表明,过量表达GhWRKY41基因,可显著提高转基因棉花在干旱、盐和低温胁迫下的发芽率;利用Real-time PCR技术,证明在盐和干旱胁迫条件下,转基因株系中GhWRKY41基因的表达量显著上升。GhWRKY41基因在根、茎和叶片中表达存在差异,根系中胁迫6h上调达到最高,茎中则胁迫48h达到最高,而叶片中仅6和24h上调表达。进一步比较转基因棉花与野生型棉花的纤维品质性状,结果表明GhWRKY41的过表达可以提高转基因棉花的衣分。因此,GhWRKY41参与了棉花响应盐和干旱胁迫应答过程,且过表达可提高转基因棉花耐盐性和耐旱性。     

陆地棉转录因子GhNAC7的克隆及功能分析

【目的】从陆地棉中克隆GhNAC7,分析其结构和功能,研究其在棉花不同组织中以及叶片不同发育时期的表达量。并转入拟南芥进一步探究其在棉花叶片衰老过程中的作用。【方法】利用中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室建立的棉花衰老叶片cDNA文库中的序列,获得1个含有NAM结构域的EST,使用Oligo6.71设计引物,重新在陆地棉叶片cDNA中进行克隆。使用Gene Structure Display Server软件分析GhNAC7结构,使用在线工具Plant CARE分析启动子序列,利用在线工具Gen Scan进行氨基酸序列翻译。同时,利用拟南芥基因组数据库(TAIR)进行序列比对,选取得分较高的NAC家族基因,使用MEGA 6.06软件和Gene Doc软件进行进化树分析和氨基酸比对。以XbaⅠ和SacⅠ为酶切位点构建35S::GhNAC7-GFP融合表达载体,分析其在洋葱表皮细胞中的瞬时表达,进行亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术分析GhNAC7在棉花不同组织、不同叶片发育时期以及在200μmol·L~(-1) ABA调控下的表达量。通过构建p GhNAC7-GUS融合表达载体并转拟南芥,分析其启动子特异性。以Eco RⅠ和SalⅠ为酶切位点,利用p BI101和p BI121载体,分别构建融合表达载体并转拟南芥进行过表达分析。【结果】从陆地棉中成功克隆GhNAC7,其全长为1 064 bp,包含3个外显子,2个内含子。生物信息学分析结果表明,GhNAC7开放阅读框为834 bp,可编码277个氨基酸,其蛋白质分子量为31.35 k D,等电点为9.22。结构域分析表明其属于NAC转录因子的NAM亚家族,进化树分析显示GhNAC7与ANAC041、ANAC083同源性最高,其中,GhNAC7与ANAC083结构域位置均为17—58 aa。其启动子核心元件包含一系列与衰老、激素、胁迫相关的顺式作用元件。亚细胞定位表明其蛋白为核蛋白。组织特异性表明GhNAC7在真叶、子叶、花、花药和衰老真叶中均明显表达,其中在衰老的真叶中表达量最高。启动子特异性分析表明,其GUS活性在衰老的叶片中最强。在拟南芥中过表达该基因,转基因植株比野生型表现出明显的衰老症状。荧光定量PCR分析表明,ABA处理后6 h GhNAC7明显上调表达,并在48 h表达量达到最高,这表明ABA可调控GhNAC7表达从而调节棉花叶片衰老。【结论】GhNAC7可以促进棉花叶片衰老并受ABA的调控。     

棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析

【目的】克隆棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的cDNA序列,并利用原核表达系统高效表达融合蛋白,检测融合蛋白的精氨琥珀酸合成酶活性及其表达对工程菌生长、耐盐能力及与游离L-瓜氨酸（L-Cit）和L-精氨酸（L-Arg）含量的影响,为解析该基因的功能及作用机制奠定基础。【方法】以拟南芥推断的精氨琥珀酸合成酶cDNA序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR技术,从棉花幼叶中获得cDNA片段,T/A克隆测序后得其序列信息,利用生物信息学软件分析其DNA结构、蛋白质结构、功能域和同源性,并构建系统进化树。利用qRT-PCR检测其在盐胁迫下的表达模式;将GhASS1的开放阅读框连接到原核表达载体pCold-TF上,构建融合表达载体pCold-GhASS1,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE法测定表达产物分子量,焦磷酸荧光法测定酶活性和比活力,HPLC法测定工程菌中L-Cit和L-Arg的含量,对比不同温度和不同NaCl浓度下工程菌与对照菌的生长速度及其体内L-Cit、L-Arg含量及L-Arg/L-Cit。【结果】棉花GhASS1存在于D基因组的第1染色体上,由10个外显子和9个内含子构成,其cDNA全长序列共1 584 bp,其中5′非翻译区22 bp,开放阅读框1 485 bp,3′端非翻译区77 bp,编码产物由494个氨基酸组成,推断分子量为54 kD,等电点6.74;序列比对分析表明GhASS1与大肠杆菌、酵母和拟南芥中同源蛋白序列一致性分别为21.81%、41.1%和78.5%,且具有典型的精氨琥珀酸合成酶结构模序;系统进化分析显示GhASS1与番茄、马铃薯和烟草中同源蛋白亲缘关系最近,而与云杉、卷柏中同源蛋白亲缘关系最远;盐胁迫可上调叶片中GhASS1的表达,1 d时达到峰值,随后逐渐下降,推测GhASS1参与棉花对盐胁迫的早期响应。表达载体pCold-GhASS1在工程菌中表达的融合蛋白分子量约108 kD,与预期相符,在体外具有精氨琥珀酸合成酶活性;与对照菌相比,pCold-GhASS1工程菌中游离L-Cit含量下降,L-Arg含量上升,且在生长周期中较快进入对数生长期;在含高浓度NaCl的培养基中pCold-GhASS1工程菌表现出更强的生长活力和较高的L-Arg/L-Cit值,显示了其具有较强的L-Cit向L-Arg的代谢流。【结论】从棉花中克隆了植物精氨琥珀酸合成酶基因cDNA序列GhASS1,推测其在植物体内可参与植物的生长和耐盐能力的调控。     

陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。     

棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

为研究XTH基因与棉花(Gossypium spp.)纤维伸长的关系,克隆了两个XTH基因,分别命名为Gh XTH1(Gen Bank:AY189971)和Gh XTH2(Gen Bank:JN968478)。Gh XTH1编码区全长870 bp,编码289个氨基酸,Gh XTH1全长885 bp,编码294个氨基酸。序列分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明,Gh XTH1和Gh XTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明,Gh XTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近,Gh XTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均随着棉花纤维发育表达量降低,Gh XTH2比Gh XTH1表达量高。