猪Ghrelin基因的克隆及原核表达

从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA，根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物，通过RT-PCR进行cDNA扩增，获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析，确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒，经NheⅠ和XhoⅠ双酶切，回收282bp的目的片段，定向克隆到pET-28a表达载体中，提取质粒并再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达．     

猪激素敏感脂酶基因克隆与序列分析

从杜长大猪的肠系膜脂肪中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增激素敏感脂酶（HSL）基因,获得一条633 bp的片段,以pGEM-T Easy Vector为载体,将该基因片断克隆到大肠杆菌中,从筛选的阳性克隆中分离出HSL基因,测定其序列.结果表明：该基因片段长633 bp,为HSL基因cDNA的部分序列;序列同源性比较表明,该基因序列与GenBank登录的HSL基因（AY686758）有高达100%的同源性.     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。     

绵羊黏膜趋化因子CCL28基因的克隆、序列分析与原核表达

利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。     

猪CuZnSOD基因片段的克隆及不同生长阶段猪肝脏CuZnSOD基因表达的差异

从体质量1、20、40、60、90kg左右的杜长大猪的肝脏组织中提取基因组RNA，RT—PCR扩增CuZnSOD基因，获得了1务255bp的片段，以pGEM—TEasyVector为载体，将该片段克隆到大肠杆菌（E．coli）中，筛选阳性克隆测定其序列，分析表明该片段与报道的猪CuZnSODcDNA部分序列同源性达到100％，编码85个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的一部分。以CuZnSOD基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT—PCR法，以18SrRNA为内标，研究不同生长阶段猪肝脏组织中CuZnSOD基因mRNA表达的差异。结果显示，1kg左右猪肝脏组织中CuZn—SODmRNA表达水平较高，体质量1～20kg猪的肝脏组织中CuZnSOD基因表达量呈下降趋势，体质量40kg的猪又显著上升，到生长后期即体质量90kg左右，CuZnSOD基因表达量又急剧下降。     

番鸭脂肪酸合成酶基因的克隆及填饲对其mRNA水平的影响简

本研究以番鸭肝脏为试验材料,通过RT-PCR扩增出番鸭脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FAS）部分CDS序列,利用相关分子生物学软件对其进行分析,同时采用实时荧光定量PCR技术检测FAS基因在成年番鸭各组织中的表达特性及填饲对番鸭肝脏和腹脂中该基因表达的影响。结果表明,克隆出的番鸭FAS基因CDS片段大小为1122 bp,编码374个氨基酸,与近缘物种禽类核苷酸同源性为92%～99%;实时荧光定量PCR结果表明,番鸭FAS基因在肝脏和腹脂中高表达,说明FAS具有组织表达特异性;填饲导致肝脏中FAS基因表达显著升高（P＜0.05）。本试验结果可为进一步研究FAS基因在番鸭肝脏脂质代谢中的作用奠定基础。     

腹水综合征肉鸡肺脏缺氧诱导因子-1α基因克隆及表达研究

从21日龄患腹水综合征（AS）鸡肺脏中提取RNA,根据健康鸡胚心室肌细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因序列（登录号为NM204297）设计引物,采用RT-PCR技术进行cDNA扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收后与载体pMD18-T连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序.结果表明,已成功克隆的阳性重组子经测序鉴定其片段大小与预期大小完全一致,为1 576 bp.序列同源性分析比较表明,该cDNA及其推导的氨基酸序列与鸡胚HIF-1α cDNA和氨基酸序列同源性分别为99%和98%.采用RT-PCR技术检测4只21日龄正常肉鸡和4只21日龄AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA,结果表明,AS患鸡肺脏HIF-1α mRNA表达丰度极显著高于正常肉鸡（P《0.01）.本试验证明,HIF-1α与肉鸡肺动脉高压导致的腹水综合征相关.     

不同生长阶段猪抗菌肽PR-39基因的表达差异

根据已报道的猪抗菌肽PR-39基因和看家基因β-actin的序列,设计了针对这两种基因的引物,构建了以MgCl2浓度为1.5 mmol/L,循环次数为29的优化半定量RT-PCR法.以β-actin为内标,研究了不同生长阶段猪抗菌肽PR-39基因的表达差异.结果表明,从1日龄到7周龄,PR-39基因表达呈上升的趋势;在7周龄到14周龄,PR-39基因表达略有下降;14周龄到21周龄,PR-39基因表达又有上升的趋势;21周龄到28周龄基因表达再次下降.     

饲养方式对河田鸡脂肪代谢的影响

本文主要研究了饲养方式、性别、日龄对河田鸡脂肪代谢的影响。试验采用28日龄河田鸡,分为笼养组、室内平养组和草地散养组,每组4个重复,笼养组每重复公母各15只鸡,平养组每重复公母各30只鸡,草地散养组每重复公母各50只鸡,公母分开饲养,在第8、12、16周分别进行屠宰分析。结果表明,饲养方式、性别、日龄对脂肪合成关键酶FAS和ME的mRNA水平及其酶活性具有显著影响,散养鸡的肝脏FASmRNA和MEmRNA水平及其酶活性显著低于笼养鸡（P〈0．05）,与之相应的是散养鸡的肌内脂肪、肌间脂肪、皮下脂肪、腹脂率显著低于笼养鸡（P〈0．05）。随着日龄的增加,肝脏FAS、MEmRNA水平及其酶活性会随着增加。母鸡的肝脏FAS、MEmRNA水平及其酶活性显著高于公鸡（P〈0．05）。从酶活性与脂肪沉积的相关性可以看出,FAS活性与腿肌IMF含量、肌间脂肪宽、皮下脂肪、腹脂率呈正相关,并且与皮下脂肪和腹脂率呈显著正相关（P〈0．05）,FAS活性与胸肌IMF呈负相关,但相关性不显著。肝脏ME活性与腿肌IMF、胸肌IMF含量呈显著正相关（P〈0．05）,而与皮下脂肪、腹脂率呈负相关（P〉0．05）。     

新兴猪IL-18成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的猪白细胞介素18(pIL-18)基因序列，设计了1对特异引物。利用RT-PCR对从3周龄新兴仔猪脾细胞中提取的总RNA进行了扩增，获得了约500bp的片段。将该片段克隆、鉴定、测序，证实已获得了新兴猪IL-18成熟蛋白基因片段，其大小为474bp，编码157个氨基酸，与GenBank上登录的猪IL-18成熟蛋白基因序列完全一致。     

Lipogenic gene expression in abdominal adipose and liver tissues of diet-induced overweight cats

The effect of overweight status on the expression of SREBP-1c and downstream lipogenic genes, such as ATP citrate lyase (ACL) and fatty acid synthase (FAS), in abdominal adipose and liver tissues was determined in cats using a diet-induced weight gain model. ACL and SREBP-1c mRNA expression was significantly reduced (～65% and 20%, respectively) in liver tissue, whereas FAS and SREBP-1c expression was significantly increased (～80% and 45%, respectively) in abdominal omental adipose tissue of overweight animals as compared to healthy animals. Additionally, ACL, FAS, and SREBP-1c expression was significantly reduced by ～50%, 75%, and 70%, respectively, in abdominal subcutaneous adipose tissue of overweight animals. Omental adipose tissue appeared to foster, whereas subcutaneous adipose and liver tissues appeared to defer lipid storage based on differences in SREBP-1c mRNA expression. Overall, reduced lipogenic gene mRNA expression patterns support the hypothesis that SREBP-1c expression is reduced in overweight and possibly obese cats, reflecting down-regulation of the lipogenic pathway to prevent further fat accumulation and weight gain.     

柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫。利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5′端的一个片段,该片段序列长819 bp,编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域。序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylit-ta)和家蚕(Bombyxmori)的Fib-H基因cDNA 5′端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%。半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5′端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势。     

柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端片段的克隆与表达分析

柳蚕(Actias selene Hübner)是鳞翅目大蚕蛾科的一种珍稀野生绢丝昆虫.利用RT-PCR方法克隆了柳蚕丝素重链基因(Fib-H)cDNA 5'端的一个片段,该片段序列长819 bp, 编码273个氨基酸,含有4个保守多聚丙氨酸结构域.序列比对分析表明,该片段序列与樟蚕(Saturnia japonica)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Antheraea pernyi)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)和家蚕(Bombyx mori) 的Fib-H基因cDNA 5'端同源序列的相似性分别为72.5%、65.8%、65.1%、65.1%、47.1%.半定量PCR分析显示柳蚕Fib-H基因cDNA 5'端片段序列在5龄幼虫第1-12天的表达量呈现逐渐上升的趋势.     

利用实时荧光定量RT-PCR检测鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达

依据鸡A-FABP和H-FABP基因及参照基因GAPDH序列设计引物,以鸡心肌、胸肌和腿肌、肝脏和腹脂总RNA逆转录合成的cDNA为模板,GAPDH基因为参照基因,应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测如皋黄鸡和安卡红鸡A-FABP和H-FABP基因的差异表达。结果表明:A-FABP、H-FABP基因和参照基因GAPDH基因融解曲线为单峰,无杂峰及二聚体,其扩增效率分别为99.7%、99.8%和100.0%。如皋黄鸡H-FABP基因在心肌、胸肌和腿肌的差异表达量分别是安卡红鸡的0.0860、0.0680倍和0.0580倍(P0.05)。H-FABP基因mRNA表达量与肌内脂肪含量呈显著负相关。如皋黄鸡A-FABP基因在腹脂和肝脏的表达量分别是安卡红鸡的15.9640倍和10.9640倍(P0.05),而在心肌、胸肌和腿肌的表达量差异不显著。     

蒙古冰草肌动蛋白基因片段的克隆与组织表达分析

本研究利用同源序列法分离蒙古冰草Actin基因同源片段,并分析蒙古冰草Actin基因在根、茎、叶中的表达特征。根据禾本科植物小麦Actin基因的保守序列设计1对引物A1,经RT-PCR扩增,从蒙古冰草cDNA中克隆到1个长度为541 bp的Actin基因片段,使用DNAman和DNAUSER等分子生物学软件进行序列分析,结果表明,该序列编码179个氨基酸,并推测该片段具有Actin超基因家族的保守结构域,含有1个ATP结合位点,抑制蛋白结合位点和胶溶蛋白结合位点;该基因片段的氨基酸序列与小麦Actin基因的同源性为99%,与玉米同源性为96%,与水稻同源性为93%。组织器官特异性表达分析结果表明,该基因在根、茎、叶中的表达量恒定。将该基因片段命名为MwACT1,并在GengBank中登记注册,登录号为FJ490410。     

金黄地鼠Kcnq1基因的分子克隆与鉴定以及在多种器官组织中的表达差异分析

对金黄地鼠Kcnq1基因进行分子克隆与鉴定以及在多种器官组织的表达差异进行分析,旨在研究Kcnq1基因在地鼠各组织器官中的功能。提取金黄地鼠心脏组织总RNA,根据大鼠Kcnq1的保守序列区域设计引物TK1,用RT-PCR的方法从金黄地鼠心脏组织中扩增出Kcnq1cDNA片段,并且以心脏cDNA片段为模板,将纯化后的cDNA在T4连接酶的作用下与pMD18-T载体特异性连接,转化感受态大肠杆菌DH5α中,筛选重组子并酶切鉴定,将鉴定后的重组子进行DNA测序。提取心、肝、脾、肺、肾各组织总RNA,并反转录,将各组织cDNA做荧光定量检测,检测各组织表达量的差异。结果显示克隆出金黄地鼠Kcnq1基因477bp的部分片段长度,推测出编码的159个氨基酸。与大鼠等物种Kcnq1基因比对,核苷酸和氨基酸序列均具有较高的同源性。荧光定量结果显示,Kcnq1在金黄地鼠心脏中表达量最高,在肺脏和肾脏中均有较高表达,在脾脏中低度表达,在肾脏中基本不表达。该研究结果为深入研究金黄地鼠Kcnq1基因功能奠定了基础。     

鸡白细胞介素18成熟蛋白全长基因的克隆与序列测定

根据已发表的鸡白细胞介素 18(IL- 18)成熟蛋白的 c DNA序列 ,设计 1对特异性引物 ,应用 RT- PCR从脂多糖(L PS)刺激 10 h活化的 MDCC- MSB1细胞中克隆到编码鸡 IL - 18成熟活性蛋白的完整基因片段 ,其大小为 5 10 bp。经序列测定证实 ,所获得的 c DNA基因序列与文献报道的结果完全一致 ,从而为进一步研究鸡 IL- 18的基因表达、生物学活性以及应用奠定了基础。