绵羊肺炎支原体多抗原表位基因MO-meAg15重组单增李斯特菌的构建及其免疫原性研究

【目的】本文研发了MO重组活疫苗。【方法】利用PCR技术从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因上下游同源片段a、b,从pMD19-T-meAg15中扩增出MO meAg15目的片段,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术将扩增得到的3个基因片段融合成ameAg15b,将其克隆测序鉴定。将ameAg15b目的基因亚克隆到pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ameAg15b重组穿梭质粒,将该重组穿梭质粒电转化至LM-SB5感受态细胞,在氯霉素、高温双重压力筛选重组菌LM-Δrli60-ameAg15b。【结果】重组菌PCR鉴定表明,外源基因meAg15定点整合于LM基因组中。遗传稳定性试验表明,meAg15基因可以在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ameAg15b可表达相对分子量为14.5 kDa的重组蛋白;Western blot分析说明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。【结论】小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ameAg15b菌体可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性。     

转录调控因子Lmo2672对LM环境适应性和应激的调控作用

【目的】本文为了解AraC家族转录调控因子Lmo2672对单核增生李斯特菌(LM)环境适应性和应激的影响。【方法】利用温控型质粒pKSV7构建LM-Δlmo2672缺失株,比较母源株LM EGD-e和缺失株LM-Δlmo2672在不同应激环境中生长情况的差异,并利用qRT-PCR方法分析转录调控因子Lmo2672缺失对应激调控基因及氧化应激相关基因转录水平的影响。【结果】与LM EGD-e相比,LM-Δlmo2672在37、42℃及含5%NaCl、0.3%胆酸盐、5 mM H_2O_2、1%Triton X-100的培养基中生长速度均显著降低(P0.05);且环境适应性及应激相关基因(prfA、lexA、fri、perR、kat、sod)转录水平显著降低(P0.05)。【结论】提示lmo2672基因在LM环境适应性和应激中发挥重要的调控作用。     

嗜线虫致病杆菌YL001 cpxR基因敲除突变株的构建及其抑菌活性研究

【目的】通过同源重组技术敲除嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001中cpxR基因,为进一步研究CpxR调节子调控抗菌物质产生的机理奠定基础。【方法】通过融合PCR技术,将cpxR基因的上、下游同源片段及质粒pJCV53上的卡那抗性基因Kmr 3个片段连接,克隆到自杀载体pDM4中,将重组质粒转化到大肠杆菌S17-1λpir中,经接合转移导入嗜线虫致病杆菌内,通过同源重组敲除cpxR基因;采用琼脂扩散法和抑制菌丝生长速率法分别测定突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用。【结果】从X.nematophila YL001基因组中成功敲除cpxR基因,得到了ΔcpxR突变菌株;ΔcpxR突变菌株对枯草芽孢杆菌和番茄灰霉病菌的抑制作用较野生菌株分别提高了1.4和1.7倍。【结论】CpxR负向调控嗜线虫致病杆菌YL001抗菌物质的产生。     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究

【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。     

布鲁菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的构建及毒力和免疫原性的评估

【目的】利用分子生物学技术,通过同源重组的方法构建了新型的羊种布鲁菌Brucella melitensis减毒活疫苗株,为布鲁菌的防治提供新的选择.【方法】以羊种布鲁菌减毒活疫苗M5株及缺失bp26基因的M5-Δbp26缺失突变株为亲本株,利用电击转化法,将含有znuA基因上下游同源臂的自杀质粒转入到亲本株中,通过同源重组敲除znuA基因.对构建的新型基因缺失株进行生物学特性及毒力的鉴定与分析.【结果和结论】PCR及核苷酸序列测序结果表明,羊种布鲁菌减毒活疫苗znuA单基因缺失株和bp26、znuA双基因缺失株均构建成功,分别将其命名为M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.与亲本株相比,2种缺失突变株的生物学特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA株具有良好的遗传稳定性.小鼠脾脏质量和脾脏菌落数表明,M5-Δbp26-ΔznuA双基因缺失株毒力最弱,单基因缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26次之.血清中抗体水平的监测显示,znuA基因的缺失对布鲁菌减毒活疫苗诱导机体体液免疫的能力没有影响.获得了免疫原性保持良好而毒力减弱的羊种布鲁菌减毒活疫苗基因突变株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA.     

林麝粪便基因组DNA的提取及PCR扩增

【目的】探索从林麝粪便中提取基因组DNA并进行物种鉴定的可行性,为林麝野外调查工作以及分子粪便学在林麝保护中的应用提供科学依据。【方法】采集林麝粪便,采用改良的CTAB抽提基因组DNA;按常规PCR法对mtDNA D-loop区和Cyt b基因进行扩增测序后,用DNAMAN 6.0软件进行系统发育分析;在不同温度存放不同时间,研究林麝粪便基因组DNA的提取与mtDNA D-loop区和Cyt b基因PCR扩增的时效性。【结果】以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增均能特异性地扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。系统发育分析结果表明:所扩增产物为林麝的mtDNA D-loop区和Cyt b基因。时效性分析结果显示:常温和4℃条件下保存96h以内的林麝粪便所提取的基因组DNA能有效扩增出mtDNA D-loop区和Cyt b基因。【结论】自然条件下林麝粪便中林麝自身体细胞DNA保存时间较长,通过在野外采集林麝粪便提取基因组DNA并进行物种鉴定是可行的。     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

绵羊肺炎支原体HSP70基因的克隆、表达及免疫原性分析

根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。     

Ac-MNPV lef-10在Sf9细胞中的表达与定位研究

【目的】研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10在宿主细胞Sf9中的时空表达及定位,为进一步研究lef-10的功能提供理论基础。【方法】利用不同的特异引物,通过PCR方法扩增lef-10及innateP-lef-10目的片段,将目的片段分别克隆到载体pTriEx-SP-GFP上,得到重组质粒pTriEx-lef10-GFP和pTriEx-innateP-lef10-GFP,经过双酶切检测构建载体。将重组质粒分别与Bacmid共转染Sf9细胞,用得到的重组病毒分别于4,8,16,24,36h再次感染宿主细胞;用激光共聚焦显微镜观察lef-10的表达及亚细胞定位情况。【结果】在感染早期,lef-10就已开始表达;随感染时间的推移,lef-10逐渐移动至细胞核,且在晚期和极晚期时相,lef-10主要集中于细胞核中。【结论】在天然条件下,lef-10是作为晩期表达因子发挥功能的,并且对其他基因的转录可能起一定的调控作用。     

山羊痘病毒疫苗株 ORF103基因的克隆、 序列分析及原核表达

根据GenBank已登录的GTPV基因组序列,设计并合成1对特异性引物,以GTPV疫苗株基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF103基因片段并进行序列分析,再将该基因片段亚克隆于原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-ORF103,经鉴定正确后转化BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDSPAGE和Western blot检测。成功克隆GTPV疫苗株ORF103基因片段。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为35ku的重组蛋白,该蛋白能与山羊痘阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为GTPV的分子生物学特性研究提供资料,并为进一步研制GTPV抗体检测试剂盒奠定基础。     

lmo2672基因缺失对LM在不同环境下生物被膜形成的影响

旨在了解AraC家族转录调控因子 lmo2672对单核增生李斯特菌(LM)生物被膜(BF)形成的影响。根据同源重组技术构建LM-△ lmo2672基因缺失株,利用结晶紫染色法比较LM EGD-e和LM-△ lmo2672在不同温度、渗透压、H_2O_2和胆酸盐环境中BF形成量的差异;通过qRT-PCR分析上述不同应激环境中BF相关基因相对转录水平的变化。研究结果证实:与LM EGD-e相比,LM-△ lmo2672在4℃,30℃,5%NaCl,8%NaCl,5mmol/L H_2O_2和0.3%胆酸盐培养环境中BF形成量显著降低;在37℃LM-△ lmo2672 BF形成能力极显著降低;在不同应激环境中,LM-△ lmo2672 BF形成相关基因的表达量均出现不同程度下降。研究结果表明, lmo2672基因在LM BF形成过程中发挥重要作用。     

山羊Δfosb基因重组腺病毒载体的构建

【目的】利用腺病毒pAdEasy-1表达系统构建含山羊Δfosb基因的重组腺病毒,为在原代细胞中研究该基因的功能奠定基础。【方法】扩增山羊的Δfosb基因,与pAdTrack连接构建pAdTrack-HA-Δfosb。用pAdTrack-HA-Δfosb转化含有pAdEasy-1的BJ5183细胞,同源重组后获得重组腺病毒质粒pAd-HA-Δfosb,用其转染HEK293细胞,包装得到重组腺病毒。对重组腺病毒进行PCR和Western blot鉴定。【结果】酶切鉴定、绿色荧光蛋白观察及PCR均证明,重组腺病毒质粒构建正确;Western blot检测到了Δfosb蛋白的表达。【结论】成功构建获得了可表达Δfosb蛋白的重组腺病毒rAd-HA-Δfosb。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因重组DNA疫苗的构建及其免疫效果评价

【目的】利用DNA改组技术（DNA shuffling）对不同谱系的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF5基因进行体外重组,构建具有良好交叉保护作用的DNA疫苗,为研制新型PRRSV疫苗提供参考。【方法】利用DNA改组技术对PRRSV谱系1、3、5.1、8.7毒株的ORF5基因进行体外突变重组,筛选去除信号肽的重组突变体。将重组突变体与真核表达载体pCAGGS-HA连接,构建重组表达质粒并进行酶切和测序鉴定,经脂质体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting试验检测目的蛋白的表达情况。将重组质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46（ORF5基因重组的DNA疫苗）免疫小鼠,试验同时设pCAGGS-HA空载体组、PBS空白对照组、弱毒疫苗组（经典弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV,MLV组）和pCA-ORF5-MLV组（ORF5基因来自Ingelvac PRRS MLV）,评估其免疫效果。【结果】筛选到2个去除信号肽的重组突变体（ΔORF5-8和ΔORF5-46）。成功构建重组表达质粒pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46,其可在MARC-145细胞中表达GP5蛋白。与pCAGGS-HA空载体组和PBS空白对照组相比,pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46组免疫小鼠血清白介素4（IL-4）和干扰素γ（INF-γ）含量均极显著提高（ORF5＜0.01）,脾淋巴细胞增殖能力均极显著增强（ORF5＜0.01）,均能产生针对GP5蛋白的抗体,血清中和试验表明,免疫组小鼠血清能对异源毒株产生交叉中和抗体（抗体平均滴度为10～16）。【结论】重组DNA疫苗pCA-ΔORF5-8和pCA-ΔORF5-46均能有效刺激并诱导机体产生细胞及体液免疫应答,具有良好的免疫原性。     

丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的克隆表达和免疫原性分析

【目的】构建表达丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740的重组表达菌,为Mmc-3740蛋白的进一步研究与应用奠定基础。【方法】采用PCR技术从Mmc-47中扩增出该基因,进行克隆、测序,将克隆质粒与pET-28a分别双酶切,回收正确的片段进行连接构建重组表达质粒,转化至表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,产物用SDS-PAGE检测,用镍柱对其纯化后免疫小鼠获得高免血清,并进行Western-blot验证。【结果】成功构建了克隆和表达载体,重组菌表达目的蛋白大小约21 ku。表达产物通过镍柱纯化后可得到单一的目的蛋白条带,Western-blot检测结果显示所表达的目的蛋白有较好的免疫原性。【结论】成功在BL21(DE3)宿主菌内表达了Mmc-3740重组蛋白。     

伪狂犬病病毒gE基因主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

【目的】为了区分伪狂犬病病毒疫苗免疫猪和自然感染猪,建立快速诊断的方法.【方法】利用PCR方法从伪狂犬病病毒中扩增出糖蛋白E(g E)基因的主要抗原表位区,用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体p ET-32a(+)中,构建重组表达质粒p ET-g E184,并转化至大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测,用纯化后的g E184蛋白作为包被抗原,建立间接g E184-ELISA检测方法.【结果和结论】用该方法检测290份临床猪血清样本,并与商品化ELISA试剂盒检测结果比较,两者的符合率为93.1%.     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。