免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究

采用间接免疫酶组织化学染色法对14日龄雏鹅人工感染GPV后，不同时间段病毒抗原在体内的定位及分布情况进行了检测。同时应用图像分析软件对抗原染色强度进行了定量分析。结果显示感染后第1天到第21天的不同时问点分别可以从心脏、肺脏、脾脏、肝脏、法氏囊、胸腺、腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和食管十二种组织器官检测到病毒抗原。其中感染第5天感染组织最广泛，抗原染色强度最强，在检测的组织中空肠的检出率最高。病毒抗原广泛分布于肠道的上皮细胞、腺上皮细胞、肺泡壁细胞和’肾小管的上皮细胞内，可见上皮细胞为GPV抗原的主要靶细胞。本试验始终未能从大脑、胰腺和骨骼肌检测到GPV。     

免疫组化方法检测细小病毒在雏鹅体内分布规律研究

利用免疫酶组织化学染色法将雏鹅进行人工感染GPV,在不同阶段病毒抗原在体内的分布状况具有不同的特点,采用影像学技术对其予以定量分析后,雏鹅于感染1～21 d可在各器官中检测到病毒抗原体,而其中在5 d时,感染分布较为广泛,因此抗原出现染色效应的最大,待检组织中空肠具有较高的检出率,而病毒抗原因此广泛存在消化道的各种上皮细胞中,由此可知上皮细胞为GPV重要的靶细胞。     

原位PCR检测雏鹅体内鹅细小病毒方法的建立及其应用

通过建立能对石蜡切片中鹅细小病毒(GPV)核酸进行定位的原位PCR方法,为GPV在鹅体内的定位、致病机理研究等提供有效的试验手段.根据GPV的VP3基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针,以GPV感染鹅肝脏和空肠组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和碱性磷酸酶标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中GPV的间接原位PCR方法并应用于自然感染GPV高免血清紧急免疫后鹅肝脏和空肠组织临床病料检测.结果显示间接原位PCR对人工感染GPV死亡鹅肝脏和空肠的石蜡标本检测结果为阳性,而鹅病毒性肝炎、鹅多杀性巴氏杆菌病、鹅沙门菌病和鹅大肠杆菌病死亡鹅肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对自然感染GPV高免血清紧急免疫后第6天的鹅肝脏和空肠组织检测20个样本中,空肠组织有8个呈阳性,肝脏组织有4个阳性结果均为阳性,阳性细胞有空肠上皮细胞、肝窦上皮细胞等.     

免疫器官中肾型鸡传染性支气管炎病毒的定位和动态分布

以鼠抗鸡肾型传染性支气管炎病毒（肾型IBV）的高免血清为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测石蜡切片肾型IBV抗原的间接酶标抗体染色技术。应用该技术对人工感染肾型IBV C9001株鸡免疫器官中的病毒进行了检测，结果胸腺和法氏囊是病毒主要侵害的免疫器官，脾脏，盲肠扁桃体仅呈一过性感染，哈氏腺未检测到，法氏囊从感染后2－12天，胸腺从感染后3－8天均检测到病毒抗原，阳性染色主要集中于法氏囊淋巴滤泡髓质区和胸腺小叶髓质区淋巴细胞和网状细胞胞浆内。     

鸡传染性支气管炎病毒MM41株感染雏鸡的组织病理学研究

为全面了解鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染引起雏鸡多个器官组织病理损伤情况,研究对IBV M41株人工感染SPF雏鸡后不同时间的气管、肺脏、肾脏、哈德氏腺、胸腺、法氏囊、脾脏、肝脏、胰腺和十二指肠进行病理组织学变化观察,同时应用实时荧光定量PCR方法对气管和肾脏中IBV载量进行检测。结果显示,IBV M41株主要侵害鸡呼吸器官气管和肺脏,分别在感染后第1、3天开始出现病变并持续2~3周。肾脏主要表现为肾小管上皮细胞轻度变性和少量淋巴细胞浸润,从第5天持续到第28天。感染后第5天,免疫器官哈德氏腺、胸腺和法氏囊开始出现不同程度的细胞变性,其中哈德氏腺最严重。感染后第3~21天,脾脏白髓面积增大,局部出现少量异嗜性细胞,病变轻微。感染5 d后,肝脏、胰腺和十二指肠先后出现轻度细胞变性,少量淋巴细胞浸润,持续到第28天。感染后第1~11天气管和肾脏病毒载量维持较高水平,分别在第5、8天达到峰值,气管病毒载量较肾脏高。结果表明,IBV M41株主要侵害鸡呼吸系统,对泌尿、免疫和消化系统也有亲嗜性;不同器官组织损伤程度和持续时间存在差异;气管和肾脏的病毒载量与组织损伤存在相关性。研究首次对IBV M41株感染雏鸡进行系统的组织病理学观察,为了解疾病发展过程、IBV致病机理和病理学诊断提供参考。     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒(GPV)B株的全基因序列，针对GPV的VP3保守基因设计了1对引物，建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约441bp的特异性片段，而对鸭瘟病毒(DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌(E．coli)Os和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒(NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达0．47pg；对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明。感染后8h即可从心、肝病料中栓出病毒DNA，感染后24h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中栓出GPVDNA，感染48h后可从骨髓中检出病毒DNA，感染312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性，对，临床送栓病料的检测结果表明，PCR的敏感性显著高于病毒分离。     

猪轮状病毒的致病性试验

为了对引起北京地区仔猪腹泻的轮状病毒进行致病性研究,购买未采食母乳的初生仔猪6头,分成2组,试验组3头仔猪口服并皮下注射三代细胞病毒1 m L,观察其临床症状;分别在感染前及感染后24、48、72、96 h等采集肛门拭子,RT-PCR检测病毒抗原,观察排毒情况;取感染5 d后的小肠、肝、脾等组织,观察病理学变化。结果显示:试验仔猪感染12 h,肛门拭子即可检测到轮状病毒,一直持续到第5天。组织切片观察发现,仔猪小肠上皮细胞及周围绒毛发生变性,上皮细胞变圆、肿胀、核肿大,细胞边缘不规则。变性细胞从基质脱落至管腔,萎缩绒毛被扁平上皮细胞覆盖,固有层有少量细胞碎片。     

流行性出血热病毒在猪体液中的分布及排毒途径的研究

用流行性出血热病毒(EHFV)进行人工感染猪实验。以RPHA和RPHIA检测体液EHFV抗原与抗体,IFA检测组织中EHFV抗原。结果分别在人工感染后第3天和第7天开始从血清、尿、粪、唾液等样品均检出EHFV抗原与抗体,而且从肺、脾、肾、脑、淋巴结检出EHFV抗原,对照组均为阴性。选用EHFV抗原阳性样品再次感染乳鼠脑,可检出特异性荧光物质。结果表明,猪感染EHFV后,在体液中分布广泛,既能在体内复制增殖,又能通过多种途径排出感染性病毒抗原,污染外环境,具备作为EHFV传染源的条件,而且是EHFV的敏感动物。然而从猪脑组织中检出EHFV抗原,说明EHFV可通过血脑屏障进入中枢神经系统参与损害,由此提示EHF病人早期出现神经症状,似乎病毒作用是不可忽视的原因之一。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒组织嗜性的研究

本研究用鸡肾型传染性支气管炎病毒 (肾型 IBV) C90 0 1株人工感染 14日龄 SPF鸡 ,于接种后定期采集病鸡的各组织器官制备成石蜡切片 ,用建立的检测石蜡切片中肾型 IB病毒的免疫酶组化染色技术 ,对人工感染肾型传染性支气管炎 (肾型 IB)鸡发病后病毒的组织器官亲嗜性和动态分布规律进行了研究。结果表明 ,肾型 IBV在胞浆内复制 ,主要亲嗜气管黏膜的上皮细胞和固有层腺体细胞、肺各级支气管上皮细胞以及肺房和呼吸性毛细管上皮细胞、气囊上皮细胞、肾和输尿管上皮细胞、消化道上皮和固有层腺体细胞、肝小叶间胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞和腺泡上皮细胞、法氏囊淋巴滤泡髓质区淋巴细胞和网状细胞、胸腺小叶髓质区淋巴细胞和网状细胞、脾小体淋巴细胞、盲肠扁桃体弥散性淋巴组织的淋巴细胞以及心肌细胞 ,病毒出现的先后顺序为气管、肺脏、肾脏、输尿管 ,消化道、法氏囊、肝脏、胰脏、胸腺和气囊 ,盲肠扁桃体 ,脾脏 ,心肌。病毒在肾脏和输尿管持续 2 0天 ,气管为 13天 ,消化道和法氏囊为 11天 ,肝脏、胰脏和肺为 10天 ,胸腺为 6天 ,气囊为 5天 ,盲肠扁桃体、脾脏、心肌呈一过性感染     

PRRSV缺失变异毒株HB-2(sh)/2002在人工感染仔猪组织中的分布与定位

用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HB-2(sh)/2002滴鼻感染30日龄健康仔猪,分别于3、7、14、28、42天宰杀,用免疫组化法对呼吸道,泌尿道,生殖道和消化道的主要器官以及脑和主要淋巴器官中的病毒抗原进行了定位分析。结果表明,在各个时间段,病毒抗原阳性率最高的器官为呼吸道、消化道沿途的淋巴结,组织中的阳性细胞多数为巨噬细胞和树突细胞,从个别猪的脑、心肌、肝和呼吸道上皮的细胞检测到阳性信号,同时发现该毒株主要在巨噬细胞和呼吸道腺上皮细胞复制。     

GPV野毒株鉴定及其致病力试验

在送检的小鹅瘟病料中分离到1株病毒,经NS1基因特异性引物扩增后确定是GPV。用该对引物对从鹅细小病毒野毒感染的病鹅分离的GPV野毒株进行PCR检测,结果该结引物能特异性地扩增出与预期片段大小相符的1.9kb片段。回归试验结果表明,该GPV野毒株的感染潜伏期为8天,病程为1-3天,致死率达100%;对雏鹅半数致死量LD50为3.4。     

小鹅瘟病毒荧光抗体的制备与应用

将小鹅瘟病毒(GPV)分离毒xw株接种健康兔获得兔抗GPV超免疫血清，由此制备兔抗GPV荧光抗体。采用直接荧光抗体试验对人工感染雏鹅、鹅胚及自然病例进行了检测。结果表明，该方法可栓出患病组织中的病毒抗原，且肠和肝的含毒量高于尿囊细胞。     

平坝灰鹅群鹅细小病毒病流行病学调查

为了解鹅细小病毒(GPV)对贵州省平坝灰鹅群的感染现状和潜在威胁,在平坝县境内采集临床健康平坝灰鹅的血清和卵,优化GPV感染鹅胚尿囊液浓缩度,使用不同浓缩度抗原进行琼脂扩散试验检测GPV血清和卵黄抗体,同时针对病毒VP3基因,利用分子生物学方法检测血清、卵黄和蛋壳带毒情况,并分析隐性感染对平坝灰鹅群的可能影响。结果表明,10倍浓缩抗原较宜于抗体检出,平坝灰鹅GPV血清抗体平均阳性率达37.3%;卵黄抗体阳性16.7%;阳性血清、阴性血清和卵黄、蛋壳表面病原核酸检出率分别为13.2%,6.7%,13.3%和0。这一结果说明GPV抗原抗体可共存在于血清,平坝灰鹅面临GPV威胁并可能长期隐性带毒,而母源抗体的存在可能是避免小鹅瘟大规模暴发的原因。     

猪流行性腹泻病毒在人工感染仔猪体内的分布

给26头3日龄仔猪经口接种猪流行性腹泻病毒(PEDV)吉毒株的猪胎肠单层细胞培养物,而后定期扑杀,采取各组织、器官,用免疫荧光染色检查病毒在猪体内的分布。结果,仅在十二指肠、空肠、回肠、回盲瓣、盲肠、结肠的粘膜上皮细胞内以及肠系膜淋巴结内发现了病毒抗原。由此认为,PEDV只引起猪的局部感染。本研究还证明,病料和固定的冰冻切片,密封低温(-20℃)保存7d和292d后,做免疫荧光染色检查时仍呈阳性结果。     

乙型脑炎病毒感染小鼠主要器官的组织病理学观察及其定位分布

为研究乙型脑炎病毒(JEV)感染小鼠后主要组织器官的损伤性变化及其在各主要器官的定位分布,本试验建立JEV感染小鼠动物模型,对感染后小鼠各组织器官进行动态病理组织学观察,并运用RNAScope染色技术了解JEV在各主要器官的定位分布。病理学观察结果显示,感染后4 d部分神经元发生肿胀变性,感染后5～10 d观察到大脑灰质神经元变性坏死,明显的血管炎性反应形成的袖套现象及胶质细胞增生,感染后10～17 d脑组织的病理学变化渐不明显。脾脏在感染后3 d,红髓淤血,脾小体周围巨噬细胞明显增多,8 d后脾小体周围的淋巴小结增生明显,可见许多新生的淋巴细胞。心肌淤血、变性并出现明显的间质性心肌炎及后期偶见心内膜下少量心肌细胞脂肪变性。肝淤血及肝细胞严重肿胀变性。肺泡壁增厚,肺泡壁上皮细胞变性肿胀及后期肺组织结构基本正常。肾小球毛细血管扩张。胃黏膜部分脱落,胃黏膜临近角质化区可以观察到小的坏死灶。十二指肠黏膜下层充血、肌层水肿、伴有少量炎性细胞浸润。空肠未见明显变化。RNAScope染色结果显示,小鼠感染后2 d,JEV核酸在脾、肾、肝、肺、胃、胰中可以检测到,在脑中检测量较少,心、空肠和十二指肠未有病毒核酸信号;因此,JEV在感染初期可能主要在小鼠外周组织分布并对外周组织具有一定的病理性损伤作用,进入中枢神经系统后主要分布于脑并对脑实质产生一定的破坏性。     

新型鸭源细小病毒安徽株AH-D15株的分离鉴定

为确定安徽省某鸭场发生的以雏鸭发育迟缓、鸭喙萎缩、舌头外伸下弯为特征的疾病病因,本研究利用PCR对病鸭样品进行检测,结果扩增出鹅细小病毒(GPV)特异性目的片段。将PCR阳性病料组织样品接种11日龄樱桃谷鸭胚,盲传3代后,可致鸭胚胚体出血严重,并且鸭喙畸形,证实分离到一株鸭源细小病毒(命名为AH-D15株)。利用第3代尿囊液感染2日龄健康樱桃谷肉鸭,2周后感染鸭出现短喙症状,并从鸭脑、肾、脾、胰腺和肝脏组织内检测到病毒。将分离病毒株的VP3核苷酸序列与Gen Bank中登录的GPV和番鸭细小病毒进行比对,结果表明AH-D15株与德国的VG32/1株和匈牙利的virulent B株亲缘关系最近,同源性分别为96.3%和96.5%。上述结果表明从病鸭体内分离到的鸭细小病毒可能来源于GPV,因此为该病的防控提供实验依据。     

鹅副粘病毒的组织嗜性

用单克隆抗体介导的免疫过氧化物酶（MC－IP）技术，对21只鹅副粘病毒病鹅体内的病毒抗原进行定位，结合组织病理学观察结果，探讨了鹅副粘病毒的组织嗜性。结果显示，除脑和心脏未检测到病毒外，在气管、肺、食道、肝脏、腺胃、胰腺、肠、哈氏腺、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏等器官都能检测到病毒，病毒抗原定位于上述器官的各种上皮细胞，淋巴细胞、网状细胞和巨噬细胞的胞浆内，其中以胃肠粘膜上皮细胞和法氏囊、胸腺、脾脏的淋巴细胞和网状细胞内检出率高，阳性反应强。这些结果提示，鹅副粘病毒是一种泛嗜性病毒，胃肠粘膜上皮和淋巴组织是其主要侵嗜部位。     

复方金银花对鸡体内NDV分布的影响

选用1日龄雏鸡,无污染环境饲养21 d后,随机分成感染组、中药治疗组、空白组。中药治疗组饮水给予复方金银花制剂。以单克隆抗体介导的免疫组化（IHC）法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,以确定复方金银花对新城疫病毒感染鸡的组织嗜性的影响。结果显示,感染组和中药治疗组鸡的16个组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒以气管、肺脏、十二指肠、空肠等器官中分布为最高。复方金银花对新城疫的组织损伤有一定的保护作用,可缩短组织修复的时间。     

荧光定量PCR检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律

2005年从山东某鹅场16日龄商品代病死鹅中分离到1株鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）,命名为SD2005株。用建立的荧光定量PCR（FQ-PCR）检测鹅细小病毒的方法,检测SD2005株人工感染3日龄雏鹅（GPV抗体阴性）后各器官不同时间段的病毒含量,结果表明：在攻毒8h后能从消化系统及血液、心脏和肝脏中检测到病毒DNA;病毒DNA的含量在48h后达到最高峰,并一直维持到168h。随后各待检脏器中病毒DNA含量持续降低,但在720h后仍能从粪便、肝脏和脾中检测到少量的病毒DNA。本试验为阐明GPV的致病机理及防控提供了重要的试验数据和理论依据。     

禽腺病毒4型ZZ株的致病性研究

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染引起的心包积液综合征(HPS)病例在国内鸡群中持续增加,前期从患有HPS的病鸡样品中分离了1株FAdV-4病毒(FAdV-4 ZZ)并获得了全基因组序列。本研究以FAdV-4 ZZ病毒株感染SPF鸡,从临床症状、存活率、组织病理学变化、病毒的组织分布情况对该毒株的致病性进行了评价。结果:FAdV-4 ZZ株感染SPF鸡96 h内,所有感染鸡全部死亡;剖检发现FAdV-4 ZZ株感染组病死鸡全部出现心包积液和肝脏变黄肿大等典型的病理变化;HE染色后,除十二指肠外,感染组病死鸡的心、肝、脾、肺、肾、腺胃、法氏囊等组织均呈现出一定的组织病理学变化;肝组织的病毒载量最高,其次为肺,而且在心脏、脾、肾、十二指肠、腺胃和心包积液中都检测到不同程度的病毒存在。这些结果表明,FAdV-4 ZZ病毒株对鸡致病性较强。